中药独活功效成分在提取物及牙膏中含量的测定方法

胡永志 刘文佳 黄 静 梁雪松 黄光伟

(柳州两面针股份有限公司,广西 柳州 545001)

引言

当今社会倡导天然、健康,产品的安全性、功效性倍受人们关注。口腔护理用品也是如此,正由于中草药具有副作用小,使用安全性高的优点,中草药牙膏现已成为市场消费的主流[1]。蛇床子素又名甲氧基欧芹酚,现代药理实验研究表明蛇床子素具有抗高血压、抗心律失常、抗衰老、抗肿瘤、抗骨质疏松症、抗炎及抗变态反应等功效[2]。将含蛇床子素提取物添加到牙膏中,可以起到一定的中药抗炎、抑制牙菌斑的作用,有利于口腔健康[3]。为保证中药材、中药提取物以及牙膏质量,对牙膏中加入的中药有效成分建立可控检测方法尤为重要。

1 仪器与材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪系统(G7129A 1260Vialsampler, G7111 1260 Quat Pump VL, G7114A 1260VWD);梅特勒-托利多ML204型电子天平;天津奥特赛恩斯仪器有限公司AS3120型超声波清洗器;LG10-2.4A离心机;蛇床子素对照品,中国食品药品检定研究所(含量以99.5%计);牙膏(规格:120g/支,柳州两面针股份有限公司生产);Fisher chemical色谱纯乙腈;超纯去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

在紫外分光光度计上扫描蛇床子素对照品溶液,取其最大吸收波长330nm为检测波长,考察了水-甲醇,水-乙腈为流动相,根据蛇床子素的峰形和杂质出峰情况,最后确定色谱条件如下:

色谱柱:Agilent C18(4.6×250mm,5μm);流动相为乙腈(B)-水(A),流动相梯度如下表1所示;流速1.0mL/min;柱温:35℃;检测波长330nm;进样量:10μL。按此色谱条件下测定,提取物、牙膏色谱图分别见图1、图2。

图1 提取物色谱图

图2 牙膏色谱图

表1 流动相梯度

2.2 对照品溶液的制备

精密称取蛇床子素对照品0.01g(精确至0.0001g)至250mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,配置成40μg/mL的对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

称取中药提取物0.1g(精确至0.0001g)至10mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,用0.45μm滤膜过滤,滤液为供试品溶液。

称取5g(精确至0.0001g)牙膏样品于50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,在转速为800rpm的条件下,常温搅拌20min分散膏体,将试样装入离心管中,以8000r/min的速度离心15min,最后离心样品取上清液经0.45μm滤膜过滤,备用。

2.4 标准曲线的绘制

分别精密量取2.2.1中蛇床子素对照品储备液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL置10mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,分别制成浓度为2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、16.0μg/mL、32.0μg/mL的标准溶液系列,依前述色谱条件进行测定。记录色谱峰峰面积,以对照品浓度(μg/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标,进行线性回归,得出蛇床子素的回归方程为:

Y=32.5462X-5.1665,r=0.99996

由以上回归方程可知蛇床子素在2.0～32.0μg/mL之间呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

分别取中药提取物和牙膏样品制备的供试品溶液,依前述色谱条件连续进样6次,测定蛇床子素含量,结果见表2。6次进样测得中药提取物中蛇床子素含量平均值为0.2284%,RSD为0.52%;牙膏样品中蛇床子素含量平均值为0.004814%,RSD为0.61%。结果表明,该方法精密度良好。

表2 精密度试验结果

2.6 稳定性试验

分别取中药提取物和牙膏样品制备的供试品溶液,依前述的色谱条件在0、0.5、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、24.0h分别进样,测定蛇床子素含量,结果见表3。结果表明,在24小时内供试品溶液稳定性良好,中药提取物中蛇床子素含量平均值为0.2276%,RSD为0.35%;牙膏样品中蛇床子素含量平均值为0.004830%,RSD为0.26%。

表3 稳定性试验结果

2.7 重现性试验

分别取同一瓶中药提取物、同一支牙膏样品,平行称取样品6份,依照2.3分别制备供试品溶液,进样测定,结果见表4。计算得中药提取物中蛇床子素含量平均值为0.2258%,RSD为0.51%;牙膏样品中蛇床子素含量平均值为0.004853%,RSD为0.41%。表明分析方法重现性良好。

表4 重现性试验结果

2.8 回收率试验

精密称取已知含量的中药提取物6份行样,分别精密加入不同量的蛇床子素对照品,搅匀,依照2.3制成供试品溶液,按上述方法进行测定,计算加标回收率,结果见表5。其平均回收率为99.95%;

表5 中药提取物回收率试验结果

精密称取已知含量的牙膏样品6份行样,分别精密加入不同量的蛇床子素对照品,搅匀,依照2.3制成供试品溶液,按上述方法进行测定,计算加标回收率,结果见表6。其平均回收率为100.64%;

表6 牙膏样品回收率试验结果

以上结果表明本方法准确可靠。

2.9 样品测定

分别取中药提取物、牙膏样品6批,依照2.3分别制备供试品溶液,进样测定蛇床子素含量,每批检测三次,计算其平均值,结果分别见表7、表8。

表7 中药提取物中蛇床子素含量测定结果

表8 牙膏样品中蛇床子素含量测定结果

2.10 样品稳定性试验

提取物置于室温下,牙膏样品分别置于室温与45℃烘箱中,在0、1、2、3、6、9、12个月时,依照2.3制成供试品溶液,按上述方法进样测定蛇床子素含量,结果分别见表9、表10。

表9 提取物中蛇床子素含量

表10 牙膏样品中蛇床子素含量

结果显示,常温下提取物中蛇床子素含量在一年考察期内没有较大幅度减少,下降为2.71%,说明蛇床子素在提取物中能稳定存在,提取物质量有保证;常温与45℃条件下,一年考察期内牙膏样品中蛇床子素含量略有下降,其中常温下蛇床子素含量下降了0.95%,45℃条件下蛇床子素含量下降1.65%。综上所述,在提取物及牙膏样品中蛇床子素能稳定存在,在提取物及牙膏有效期内均能保持良好的功效。

3 讨论

在实验过程中先后采用Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)、Agilent C18(4.6×250mm,5μm)、Kromasil C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)分离蛇床子素,经反复实验,最终确定用Agilent C18作色谱柱,流动相为乙腈(B)-水(A),梯度洗脱:0～10min,60%～80%B;流速1.0mL/min;柱温:35℃;检测波长330nm;进样量:10μL。在此条件下蛇床子素色谱峰形较理想。本方法测定提取物及牙膏中蛇床子素含量,样品处理方法简便,流动相组成简单,结果可靠,为含蛇床子素提取物及牙膏建立相应的质量控制方法提供可靠依据。在功效型中草药牙膏开发中,起到有效技术指导作用,更好优化产品研发。在产品推广上市中,有效减少产品推广上市风险,并能为消费者提供值得信赖的数据支持。