基于TARGET数据库筛选儿童急性髓细胞白血病的关键基因和信号通路

邓颖，熊安秀，刘景珍，祁闪闪，熊昊

（1. 华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院公共卫生科，武汉 430015； 2. 宜昌市中心人民医院儿科，湖北 宜昌 443003； 3. 恩施州中心医院儿童血液消化心血管肾病中心，湖北 恩施 445099； 4 .华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院儿童血液疾病研究室，武汉 430015； 5.华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院血液肿瘤科，武汉 430015）

急性髓细胞白血病 （acute myeloid leukemia，AML）约占儿童白血病的20%～25%［1］。虽然与急性淋巴细胞白血病相比，儿童AML的发病率低，预后较差。目前，AML的总生存率不到70%，复发率高达25%～35%［2-3］。细胞遗传学被认为是AML风险分层的主要依据，然而在临床实践中，接近半数的AML患儿细胞遗传学正常，疾病的转归却有着显著的差异［4］。近年来，随着二代基因测序技术的发展，AML相关的重现性遗传学异常逐渐被发现，并且在AML诊断、治疗和预后等方面的重要性日益凸显，但仍有部分患儿未携带已知的遗传学异常。因此，探究与儿童AML相关的新的分子生物标志物有助于对AML患儿进行风险分层。本研究通过下载和整理有效治疗方法适用性研究 （therapeutically applicable research to generate effective treatments，TARGET） 数据库中儿童AML的基因表达数据和临床信息，利用生物信息学分析手段对AML相关的致病基因进行挖掘，以期为探索AML的发病机制及分子标志物的筛选提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 基因表达数据信息

通过TARGET网站 （https：//ocg.cancer.gov/programs/target） 检索并下载儿童AML的临床信息和基因表达数据。TARGET数据库包含121例AML患儿的临床信息，其中，女性患儿63例，男性患儿58例。TARGET数据库中AML患儿的基因表达数据和临床信息来自美国儿童肿瘤协作组 （children’s oncology group，COG） 的美国AML （America acute myeloid leukemia，AAML） 0531 Ⅲ期临床试验。

1.2 差异表达基因的筛选

采用R软件的DESeq2包对TARGET数据库AML患儿的基因表达数据进行差异表达基因筛选，筛选条件为差异表达上调或下调≥2倍，即 | log2FC |≥1，且P< 0.05。

1.3 差异表达基因的生物信息学分析

采用DAVID在线数据库对筛选出的差异基因进行基因本体论 （Gene Ontology，GO） 注释和京都基因与基因组数据库 （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 信号通路注释，分析差异基因参与的生物学过程（biological process，BP） 以及涉及的相关通路，以P< 0.05 为入选标准。应用STRING在线数据库构建差异基因的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络结构图，然后使用Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化，并通过cytoHubba插件筛选hub基因。

1.4 枢纽（hub）基因的验证

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。使用R语言的survival包计算hub基因表达量的最佳cut-off值，并将表达量

2 结果

2.1 差异基因的筛选

TARGET数据库中有121例AML患儿的临床信息，除7例危险度分层未知外，其余114例患儿中48例低危，61例中危，5例高危。进一步对114例患儿初诊时骨髓标本的基因表达信息进行分析。相较于低危患儿，中高危患儿有2 092个差异基因，其中上调基因1 167个，下调基因925个 （图1A）。相较初诊患儿，39例复发患儿有785个差异基因，其中上调基因184个，下调基因601个 （图1B）。绘制2组差异基因的韦恩图，共得到差异基因96个，其中上调基因38个（图1C），下调基因58个 （图1D）。

图1 TARGET数据库AML患儿差异基因的筛选Fig.1 Screening of DEGs of childhood AML using the TARGET database

2.2 差异基因的GO富集分析和KEGG富集分析

采用DAVID数据库对96个差异基因进行GO富集分析。结果显示，差异基因在细胞组分 （cellular component，CC） 主要富集于核小体、细胞质、晚期内体膜、核染色体、浓缩染色体外着丝粒，在BP中主要富集于核小体组装、染色体分离、对有毒物质的反应、染色质沉默、纺锤组织，在分子功能 （molecular function，MF） 主要富集于蛋白质异二聚活性、DNA结合、染色质结合、微管结合、MAP激酶酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，见图2A。96个差异基因的KEGG通路富集分析结果显示，差异基因在酗酒、系统性红斑狼疮、病毒致癌等通路聚集，见图2B。

图2 差异基因的富集分析Fig.2 Enrichment analysis of DEGs

2.3 分析与AML相关的hub基因

通过 STRING 数据库构建96个差异基因的PPI网络 （图3A）。除去孤立无关系的蛋白节点，通过Cytoscape 软件对差异基因进行PPI 网络的可视化（图3B），颜色越红，关联性越强。在Cytoscape 软件的cytoHubba模块，分别使用Betweenness、EPC、MCC、Radiality、Stress等5种计算方法计算 PPI 网络节点的前10个有较高连接度的hub基因，见表1。得到的15个hub基因分别是细胞分裂周期相关蛋白2 （cell division cycle associated 2，CDCA2）、细胞周期蛋白依赖激酶1 （cyclin dependent kinase 1，CDK1）、着丝粒蛋白E （centromere protein E，CENPE）、DNA甲基转移酶3B （DNA methyltransferase 3 beta，DNMT3B）、二肽基肽酶4 （dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、核酸外切酶1 （exonuclease 1，EXO1）、TTK蛋白激酶 （TTK protein kinase，TTK）、FOS原癌基因 （Fos proto-oncogene，FOS）、H2B聚集组蛋白5 （H2B clustered histone 5，H2BC5）、H3聚集组蛋白4 （H3 clustered histone 4，H3C4）、H3聚集组蛋白10 （H3 clustered histone 10，H3C10）、H2A聚集组蛋白19 （H2A clustered histone 19，H2AC19）、H2A聚集组蛋白20 （H2A clustered histone 20，H2AC20）、H2B聚集组蛋白21 （H2B clustered histone 21，H2BC21）、转化生长因子β1诱导转录1（transforming growth factor beta 1 induced transcript 1，TGFB1I1）。

表1 5种计算方法的前10个hub基因Tab.1 The top 10 hub genes identified by five centrality methods

图3 差异基因的PPI分析Fig.3 PPI analysis of DGEs

2.4 hub基因与AML患儿临床病理特征的相关性

采用χ2检验分析AML患儿临床病理特征 （包括性别、年龄、初诊时外周血白细胞、中枢浸润、危险度分层） 与15个hub基因表达量之间的相关性。结果表明hub基因的表达与男女比例、年龄分布、是否中枢侵犯等无相关性 （均P> 0.05）。DNMT3B、DPP4、CENPE、TTK、CDCA2、EXO1、CDK1的高表达与危险度分层呈正相关 （均P< 0.05），H2BC21、H2AC19、H3C10、FOS、H3C4、TGFB1I1、H2BC5、H2AC20的高表达与危险度分层呈负相关 （均P< 0.05）。DPP4、CENPE、TTK、CDCA2基因高表达组患儿初诊时外周血WBC高于低表达组 （均P< 0.05），H2BC21、H2AC19、H3C10、FOS、H3C4、H2BC5、H2AC20基因高表达组患儿初诊时外周血白细胞低于低表达组（均P< 0.05），DNMT3B、EXO1、CDK1、TGFB1I1基因高表达组和低表达组患儿初诊时白细胞计数无统计学差异 （均P> 0.05）。

2.5 hub基因与AML患儿预后的关系。

对15个hub基因进行单因素Cox回归分析，结果显示，DNMT3B、DPP4、CENPE、TTK、CDCA2、EXO1、CDK1等基因的高表达和H2BC21、H2AC19、H3C10、FOS、H3C4、TGFB1I1、H2BC5、H2AC20等基因的低表达是影响AML患儿总生存期的危险因素。对以上因素进行多因素Cox比例风险模型分析，结果显示，15个相关联的hub基因中DNMT3B的高表达、DPP4的高表达、CENPE的高表达、H3C10的低表达是AML患儿总生存期的独立危险因素，见表2。

表2 hub基因的单因素和多因素分析构建预后风险模型Tab.2 Univariate and multivariate Cox regression analyses of the hub genes for constructing prognostic risk models

3 讨论

本研究通过分析TARGRT数据库AML患儿的基因表达数据，筛选出与危险度分层和复发相关的96个差异基因。GO和KEGG富集分析结果显示，差异基因编码的蛋白主要富集于细胞核和细胞质，参与的BP主要有DNA结合、核小体组装、染色体分离等。

在筛选出的hub基因中，DNMT3B与DNA甲基化的相关。DNMT3B负责DNA的从头甲基化。虽然在AML中DNMT3B的突变很少见，但DNMT3B的高表达预示着高耐药率和高复发率［5-6］。髓过氧化物酶 （myeloperoxidase，MPO） 是诊断AML的生物标志物，其高表达与更好的预后相关。据报道，DNMT3B可以上调AML细胞MPO启动子的甲基化，抑制MPO的表达。而且DNMT3B对MPO启动子的甲基化不受AML常见突变 （FLT3-ITD、CEBPA或NPM1突变） 的影响［7］。此外，DNMT3B高表达导致DNA超甲基化在T细胞急性淋巴细胞白血病和伯基特淋巴瘤中也有报道［8］。

DPP4表达于骨髓来源的细胞、骨骼肌细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞等［9-11］。在慢性白血病，尤其是慢性B淋巴细胞白血病中，有大量研究［12-14］证明了DPP4的促癌作用。DPP4的表达影响临床分期、治疗缓解所需时间、总生存期、无病生存期，是负性的预后因素。虽然急性白血病样本中，包括T细胞急性淋巴细胞白血病、B细胞急性淋巴细胞白血病和AML，白血病细胞膜DPP4的表达量与非白血病患者无差异，但白血病患者血浆sCD26/DPP4明显高于非白血病患者［15］。

CENPE、CDCA2、CDK1、TTK、EXO1、FOS与细胞周期、细胞增殖密切相关。在AML中，CDK1的促癌作用相对明确，但关于CENPE、CDCA2、TTK、EXO1、FOS的报道较少。H2BC5、H2AC19、H2AC20、H2BC21、H3C4、H3C10是组蛋白H2和H3的成员，是构成核小体的重要组成部分。目前，关于TGFB1I1、H2BC5、H2AC19、H2AC20、H2BC21、H3C4、H3C10在AML致病机制中的作用少有报道。

综上所述，本研究通过对TARGET数据库AML患儿初治时低危组与中高危组的骨髓差异基因、初治时与复发时骨髓差异基因的综合分析，发现CDCA2、CDK1、CENPE、DNMT3B、DPP4、EXO1、TTK、FOS、H2BC5、H3C4、H3C10、H2AC19、H2AC20、H2BC21和TGFB1I115个与儿童AML相关的hub基因。这15个基因均与预后相关，尤其是影响预后的独立危险因素的DNMT3B、DPP4、CENPE和H3C10基因可能成为儿童AML的分子机制研究以及预后判断的新靶点。