油橄榄果渣低糖复合咀嚼片的研制和抗氧化作用及安全性评价

叶文斌，樊亮，胡文斌，杨文，孙娜，王林林

（1.陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃成县 742500）

（2.陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃成县 742500）

（3.陇南师范高等专科学校数信学院，甘肃成县 742500）

油橄榄（Olea europaea）是世界著名的木本油料树种[1]，上世纪50 年代由从地中海沿海引种到我国，陇南是我国最适宜栽培种植地区，也是全国主产区。而油橄榄所结果实鲜榨后即为橄榄油，在橄榄油加工过程中会产生大量的油橄榄果渣，而果渣中含有大量矿物质和多酚类营养物质，具有开发成功能性食品的巨大潜力[2-7]，但目前除将其作为肥料和饲料外，长期得不到高效的利用，造成了严重的资源浪费和环境污染[2]，金耳[Naematelia aurantialba（Bandoni &M.Zang）Millanes &Wedin]为著名药食兼用菌，药性温中带寒、味甘，具化痰、止咳、定喘、调气平肝阳的功效[8]，现代研究表明，其子实体含有人体必不可少的蛋白质、氨基酸、胶质物、胡萝卜素、多种维生素及矿物质等，在降血糖血脂、保肝、抗血栓、抗氧化、抗辐射等方面具有很高的食用价值和保健功能[9-11]。黄果槲寄生果实多糖是黄果槲寄生[Viscum coloratum（Kom.）Nakai f.lutescensKitag]果实中所分离得到的主要有效生物活性成分，主要由高度酯化半乳糖聚合物、中性多糖及酸性多糖[12]等多糖组成，具有出众的流变学特性和众多的生理活性[13-15]。而咀嚼片是形状各异、外表美观的片剂食品，具有携带方便、食用便利等优点，是大众喜爱和流行的食品，且呈现的固态状态更具营养的稳定性，保质和贮藏时间较长，是食品最流行的加工方法之一[16-18]。

为此，以油橄榄果渣为原料，同时添加金耳粉、黄果槲寄生果实多糖和食品添加辅助成分，研制一种可以直接食用的低糖复合咀嚼片，开展单因素筛选试验，优化最佳工艺，开展安全和抗氧化作用评价，为陇南油橄榄果渣开发保健新产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鲜油橄榄果渣，由陇南市经济林研究院提供；洁净级KM 小鼠，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，许可证号：SCXK(甘)2020-0002。黄果槲寄生果实多糖，由陇南师范高等专科学校农林技术学院食品实验室提供，纯度为为99.65%；金耳，由陇南康元生物科技有限公司提供；木糖醇、柠檬酸、硬脂酸镁、D-异抗坏血酸钠、氯化钠、氯化钙均为食品级；总抗氧化能力（ABTS+·）试剂盒、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）试剂盒、羟自由基（·OH）试剂盒、超氧阴离子（O2-·）检测试剂盒，均购自上海舒话生物科技有限公司。SOD、CAT、GSH-Px 酶活性和MAD 含量检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所有限公司；XC-750 粉碎机，购自浙江永康石柱铂欧五金厂；DK-S24 恒温水浴锅，购自上海精宏实验设备有限公司；台式离心机，购自上海安亭科学仪器厂；THDP-6单冲压片机，购自上海天阖机械；UV-2100 紫外可见分光光度计，购自龙尼柯仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

陇南油橄榄果渣→烘干→过筛→粉碎→碱法提取→膳食纤维→加到氯化钠溶液→添加黄果槲寄生果实多糖粉末→添加金耳粉末→添加氯化钙→添加D-异抗坏血酸钠→添加麦芽糊精→添加柠檬酸→添加木糖醇→硬脂酸镁→制软材→湿法造粒→干燥→整粒→压片→灭菌→包装

1.2.2 工艺要点

选取新鲜完整的金耳，切成4 mm 薄片，用清水冲洗干净后，于60 ℃干燥箱中干燥8 h，干燥器内冷却，粉碎后过200 目筛，备用。将新鲜的油橄榄果渣在50 ℃烘箱中干燥杀青，过100 目筛，超微粉碎6 000目过筛成粉末备用。取100 g 果渣粉末添加到350 mL 0.008 g/mL 的NaOH 碱液中，在70 ℃水浴锅中进行碱法提取处理，40 min 后，在4 000 r/min 转速下离心，对上清液减压浓缩后，用4 倍体积的φ=95%乙醇醇沉过夜，沉淀用φ=95%乙醇洗至中性。50 ℃条件下真空干燥至恒重，粉碎得水溶性膳食纤维，对离心分离得到的滤渣，用蒸馏水洗至中性，50 ℃条件下真空干燥至恒重，粉碎得水不溶性膳食纤维，去掉杂质的总膳食纤维得率为92.73%。将所获得的总膳食纤维添加到0.10%（m/V）的氯化钠溶液中，在振荡频率为160 r/min的摇床中振荡10 min，搅拌均匀，添加0.25%（m/m）黄果槲寄生果实多糖粉末和6.0%金耳粉末，在摇床中振荡10 min 搅拌均匀，再添加0.01%（m/m）的氯化钙和0.03%（m/m）的D-异抗坏血酸钠继续振荡搅拌10 min，再添加0.50%（m/m）的麦芽糊精、0.18%（m/m）柠檬酸振荡搅拌10 min 后，分别添加16%（m/m）的木糖醇和1%（m/m）硬脂酸镁振荡搅拌10 min，待稳定后迅速冷冻干燥，添加少量水分制备的甜味油橄榄低糖果渣膳食纤维粉软材，干燥整粒压片，脱气灭菌装瓶包装后，室温阴凉干燥处保存。

1.2.3 咀嚼片制备工艺单因素试验

将制备的陇南油橄榄果渣膳食纤维粉按照总量的80%添加，确定好添加量后，加入到用蒸馏水配制成质量比为0.10%（m/V）的氯化钠溶液中，添加一定比例的木糖醇、柠檬酸、黄果槲寄生果实多糖和金耳粉末，再添加0.01%（m/m）的氯化钙、0.03%（m/m）的D-异抗坏血酸钠、1%（m/m）的硬脂酸镁和0.50%（m/m）的麦芽糊精，开展低糖油橄榄果渣膳食纤维制备的咀嚼片单因素筛选。从咀嚼片的组织形态、口感、风味和色泽进行综合感官评定，木糖醇的添加量以质量比（m/m）为12%、14%、16%、18%和20%来进行筛选，在其他条件不变的情况下，柠檬酸的添加量以质量比（m/m）为0.14%、0.16%、0.18%、0.20%和0.22%来进行筛选，黄果槲寄生果实多糖的添加量以质量比（m/m）为0.15%、0.20%、0.25%、0.30%和0.35%来进行筛选，金耳粉末的添加量以质量比（m/m）为2%、4%、6%、8%和10%来进行筛选。

1.2.4 感官综合评价与质量指标测定

将制备好的油橄榄果渣低糖复合咀嚼片放置7 d，邀请10 名食品相关专业人员从组织状态、口感、风味、色泽等方面进行感官评价，总分为100 分。评价等级和标准参考张梦宇等[17]和任小莉等[19]的方法有改动，感官评价标准如表1 所示。质量指标测定参考汤葆莎等[20,21]的方法通过测定咀嚼片硬度、崩解时限、脆碎度和片重差异来考察；总砷、总铅、总镉、总汞按照GB/T 5009.11、GB/T 5009.12、GB/T 5009.15-2014 和GB/T 5009.17-2014 中的方法测定，商业无菌、霉菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌按GB/T 4789.26、GB/T 4789.15-2003、GB/ 4789.4-2016 和GB/ 4789.10-2016所规定的方法测定；体外抗氧化指标（ABTS+·、DPPH·、·OH 和O2-·清除能力）依据试剂盒的方法进行检测。

表1 油橄榄果渣低糖复合咀嚼片感官评价Table 1 Sensory evaluation of olive pomace low-sugar compound chewable tablets

1.2.5 对小鼠急慢性毒理实验

选取25～28 g KM 小鼠120 只，适应性喂养7 d后，随机分为12 组，每组10 只，雌雄各半。采用最大耐受剂量法，先取50 只小鼠分别灌胃制备好的咀嚼片溶液，将咀嚼片粉碎成粉末用蒸馏水配成溶液，以5 000、10 000、15 000、20 000 和250 000 mg/(kg·bw)标准空腹一次性灌胃，后取50 只小鼠以灌喂等体积的生理盐水为CK（0）组，灌胃后观察其急性中毒症状、体征，饲料和水正常饲喂，连续观察7 d，检测急性LD50和生理指标等[22]；再取10 只小鼠灌胃制备好的咀嚼片溶液，以400 mg/kg·bw 标准空腹灌胃，再将10 只小鼠以灌喂等体积的生理盐水为CK（0）组，连续灌胃90 d，饲料和水正常饲喂，在观察其中毒症状、体征时，检测30、60 和90 d 后的生理指标，观察慢性毒理小鼠生活情况[22]，小鼠急慢性毒理实验中血清中SOD、CAT、GSH-Px 酶活性和MAD 含量全部用试剂盒中的方法进行检测。

1.3 数据统计

实验所得数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析，显著性分析采用单因素方差分析进行比较，P＜0.05为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

木糖醇、柠檬酸、金耳和黄果槲寄生果实多糖添加量对咀嚼片综合感官评价由图1～2 所示，由此可以看出：咀嚼片的综合感官评价分值均随着四种因素添加量的升高而逐渐升高，木糖醇、柠檬酸、金耳和黄果槲寄生果实多糖添加量分别在16%、0.18%、6%和0.25%时综合感官评价分数最高。木糖醇添加量在14%和18%、柠檬酸添加量在0.16%和0.20%、金耳在4%和8%、黄果槲寄生果实多糖添加量在0.20%和0.30%时咀嚼片的综合感官评分数都呈下降趋势。所以可以确定14%、16%和18%的木糖醇、0.16%、0.18%和0.20%的柠檬酸、4%、6%和8%的金耳以及0.20%、0.25%和0.30%黄果槲寄生果实多糖为后续的响应面实验参数，来优化咀嚼片加工工艺。

图1 木糖醇和柠檬酸对咀嚼片感官评价的影响Fig. 1 Effects of xylitol and citric acid on sensory evaluation of chewable tablets

图2 金耳和黄果槲寄生果实多糖对咀嚼片感官评价的影响Fig. 2 Effect of Naematelia aurantialba and Viscum coloratum fruit polysaccharides on sensory evaluation of chewable tablets

2.2 咀嚼片响应面试验设计与结果

选取木糖醇添加量（A）、柠檬酸添加量（B）、金耳添加量（C）和黄果槲寄生果实多糖添加量（D）为试验因素，以综合感官评分为响应值，按照Box-Behnken 中心组合实验设计，优化加工工艺确定了咀嚼片的响应面试验因素水平表[23,24]，如表2 所示。

表2 响应面中心组合实验设计工艺因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-behnken design

通过对油橄榄果渣低糖复合咀嚼片进行响应面实验设计和结果的综合感官评价，得到了试验因素的回归模型为：

方差分析结果和响应面实验设计结果如表3和4所示，由此可知，经检测模型显著（P＜0.001），决定系数（R2）和校正系数（R2adj）分别为0.935 5 和0.953 2，两者接近，响应面拟合较好[2,23,24]，而且模型失拟项不显著（P=0.972 7），试验误差小。综合分析该方程能很好地反映复合咀嚼片品质与四个因素之间的响应关系[2]。模型中A 和D 的一次项为显著水平（P＜0.01），C 的一次项为极显著水平（P＜0.05），而B 的一次项不显著，四个二次项（A2、B2、C2和D2）都达到了极显著水平（P＜0.01），而且除A 和D 交互项不显著外（P＞0.05）、其他交互项都表现出极显著差异水平（P＜0.01），说明木糖醇、柠檬酸、金耳和黄果槲寄生果实多糖添加量与复合咀嚼片加工工艺影响显著，表明复合咀嚼片各因子的试验值与预测值接近，可信度较高，可用于复合咀嚼片加工工艺优化的理论预测[2,23,24]。通过模型和方差分析可以确定影响复合咀嚼片品质的因素大小顺序为：金耳添加量（C）＞木糖醇添加量（A）＞黄果槲寄生果实多糖添加量（D）＞柠檬酸添加量（B）。

表3 复合咀嚼片工艺优化响应面模型分析Table 3 Response surface model analysis of composite chewable tablets process optimization

表4 复合咀嚼片响应面实验设计与结果Table 4 Response surface design and results of compound chewable tablets

响应曲面的坡度和等高线都可直观反映出添加因素对复合咀嚼片感官品质的敏感度[2,23,24]，四种因子之间交互作用对对复合咀嚼片感官品质的结果如图3～8所示。响应面存在着最高值，而且四个因子之间交互影响均在等高线范围之内，说明影响复合咀嚼片最优条件就在所选的浓度范围之内[2,23,24]。通过响应面分析预测的最佳工艺参数为：木糖醇添加量为18%、柠檬酸添加量为0.16%、黄果槲寄生果实多糖添加量为0.25%、金耳添加量为6%，而且复合咀嚼片最佳优化工艺的理论预测综合感官评价为95.54（分），按照预测的最佳优化工艺重复实验，复合咀嚼片综合感官评价值为94.93（分），和理论值相比没有差异（P＞0.05），与单因素实验的结果一致。而且在优化的配方中用木糖醇作为甜味剂，不但丰富了营养成分，还适用于糖尿病患者[5,25]；添加柠檬酸和D-异抗坏血酸钠既可以增加立体的酸味感觉，又能提高保存时间，并有阻止氧化酸败，稳定产品的颜色的作用[25,26]，添加氯化钙可以强化咀嚼片的均一性。添加黄果槲寄生果实多糖不但增添了保健功能[13-15]，更为增添了口感的层次性。

图3 木糖醇和柠檬酸添加量对咀嚼片感官品质的响应图Fig. 3 Response of xylitol and citric acid addition to the sensory quality of chewable tablets

图4 木糖醇和金耳添加量对咀嚼片感官品质的响应图Fig. 4 Response of xylitol and Naematelia aurantialba to the sensory quality of chewable tablets

图5 木糖醇和黄果槲寄生果实多糖添加量对咀嚼片感官品质的响应图Fig. 5 Response of xylitol and Viscum coloratum fruit polysaccharide addition to the sensory quality of chewable tablets

图6 柠檬酸和金耳加量对咀嚼片感官品质的响应曲图Fig. 6 Response of citric acid and Naematelia aurantialba addition to the sensory quality of chewable tablets

图7 柠檬酸和黄果槲寄生果实多糖添加量对咀嚼片感官品质的响应图Fig. 7 Response of citric acid and Viscum coloratum fruit polysaccharide addition to the sensory quality of chewable tablets

2.3 感官评价和质量指标测定

油橄榄果渣低糖复合咀嚼片的抗氧化能力由图9～10 所示。用Vc 和咀嚼片对比考察抗氧化作用，随着咀嚼片的质量浓度升高，对ABTS+·、DPPH·、·OH和O2-·清除能力也随之升高，所表现出的综合抗氧化能力也随之增强，但均比Vc 弱。在5 mg/mL 的浓度下，复合咀嚼片所表现出的ABTS+·、DPPH·、·OH 和清除率分别为91.28%、83.47%、67.58%和79.84%，与同等浓度的Vc 相比均呈显著性差异（P＜0.05）。

图9 咀嚼片和Vc 对ABTS＋·和DPPH·的清除率Fig. 9 ABTS+· and DPPH radical scavenging by chewable tablets and Vc

图10 咀嚼片和Vc 对超氧阴离子和羟基自由基的清除率Fig. 10 Superoxide anion and hydroxyl radical scavenging by chewable tablets and Vc

对油橄榄果渣低糖复合咀嚼片进行3 次重复试验，考察崩解时限、硬度、质量差异以及减失质量百分比等质量指标，结果如表5 所示，由此可知：重复试验的咀嚼片均在13 min 左右崩解完成，硬度在42～45 N 范围之内，均大于30 N，质量差异在7.5%上下，减失质量百分比小于0.50%。通过对制得片剂咀嚼片质量指标测定可以看出，制备工艺优化已达到片剂制备质量标准要求[20,21]。制备的复合咀嚼片形态完整，断面结构细密、无粉末，硬度适中、薄厚均匀，酸甜适中、咀嚼性好、无颗粒感，油橄榄特有风味突出，整体气味协调较好、无其他异味，颜色淡棕色，均匀一致，对其进行理化指标和微生物指标检测，各项理化指标均符合《中国药典》2015 版要求，未检出致病菌，结果如表6 所示。

表5 油橄榄果渣低糖复合咀嚼片质量指标Table 5 Quality indes of olive pomace low-sugar compound chewable tablets

表6 油橄榄果渣低糖复合咀嚼片的微生物指标Table 6 Microbiological index of olive pomace low-sugar compound chewable tablets

2.4 对小鼠急慢性毒理检测

油橄榄果渣低糖复合咀嚼片对小鼠口服灌胃急性毒理实验中，一次性灌服最大剂量为25 000 mg/kg·bw，给药后依据叶文斌等[22]的方法笼边观察7 d，给药后各组小鼠外观毛色光亮，无窜动跳跃、竖毛扭体等异常反应现象，小鼠活动自如，摄食进水、大小便正常，未出现死亡，LD50未检出，根据毒理学评价标准，LD50＞10 000 mg/kg·bw 属于无毒性物质[22]，对小鼠血清中生化指标进行检测，结果如图11～12 所示。灌胃剂量为25 000 mg/kg·bw，7 d 后对小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量进行检测后，小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量均升高与CK（0）相比成极显著性差异（P＜0.01）；对小鼠进行颈椎脱臼处死，进行重要脏器病理检查，均未出现明显病理变化，说咀嚼片对小鼠急性毒理安全。对小鼠口服灌胃慢性毒理实验中，灌服剂量均为400 mg/kg·bw，连续灌胃90 d，给药后依据叶文斌等[22]的方法持续观察，对小鼠血清中生化指标进行检测，结果如图13～14所示。在灌胃剂量为25 000 mg/kg·bw，连续灌胃90 d后，小鼠血清中SOD、CAT 与GSH-Px 活性与CK（0）之间相比均呈极显著升高（P＜0.01），小鼠血清中MDA 的含量与CK（0）之间相比均呈极显著降低（P＜0.01），对重要的脏器进行病理检查，均未出现明显病理变化。在急慢性毒理实验中通过提高机体的内源抗氧化酶SOD、CAT 与GSH-Px 活性而提高机体的抗氧化能力，启动CAT 就可以有效分解H2O2，降低H2O2对细胞的损伤[27]，同时在清除自由基诱发的脂质过氧化产物的时候GSH-Px 和SOD 与CAT 一同保护了肝细胞膜结构和功能的完整性[27]，降低了机体内脂质和组织过氧化程度，进而减少MDA 的含量。

图11 咀嚼片对小鼠急性毒理SOD 和CAT 活性的影响Fig. 11 Effect of chewable tablets on SOD and CAT activity in mice with acute toxicity

图12 咀嚼片对小鼠急性毒理GSH-Px 活性和MDA 含量的影响Fig. 12 Effect of chewable tablets on GSH-Px activity and MDA content in mice with acute toxicity

图13 咀嚼片对小鼠慢性毒理SOD 和CAT 活性的影响Fig. 13 Effect of chewable tablets on SOD and CAT activity in mice with chronic toxicologica toxicity

图14 咀嚼片对小鼠急性毒理GSH-Px 活性和MDA 含量的影响Fig. 14 Effect of chewable tablets on GSH-Px activity and MDA content in mice with chronic toxicity

综上所述，复合咀嚼片可以提高小鼠体内SOD、CAT 与GSH-Px 等内源抗氧化酶活性，增强机体的抗氧化能力，降低机体内脂质和组织过氧化的程度，进而减少MDA 的含量，对小鼠属于急慢性无毒性物质。

3 结论

以陇南油橄榄果渣膳食纤维为材料复配金耳和黄果槲寄生果实多糖，添加木糖醇、柠檬酸、氯化钙和D-异抗坏血酸钠等食品添加剂研制油橄榄果渣低糖复合咀嚼片，根据综合感官评价，进行响应面设计实验，优化的配方为木糖醇、柠檬酸、金耳和黄果槲寄生果实多糖添加量分别为16%、0.18%、6%和0.25%，并添加0.01%的氯化钙和氯化钠、0.03%的D-异抗坏血酸钠、1%的硬脂酸镁和0.5%的麦芽糊精。研制的低糖复合咀嚼片形态完整，断面结构细密、无粉末，硬度适中、薄厚均匀，酸甜适中、咀嚼性好、无颗粒感，油橄榄特有风味突出，整体气味协调较好、无其他异味，颜色淡棕色，均匀一致，对其进行理化指标和微生物指标检测，各项理化指标均符合国家安全标准，一次性灌胃25 000 mg/(kg·bw)观察7 d 和400 mg/(kg·bw)标准连续灌胃小鼠90 d，结果显示其无急慢性毒理作用。对咀嚼片进行抗氧化能力检测，表现出较好的ABTS+自由基、DPPH 自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基清除能力，通过最优化的配方所得到的咀嚼片，实际测得感官评分与模型预测值相近，检测的重金属含量均低于国家安全标准（＜0.05 mg/kg），未检出沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等致病菌，大肠杆菌数和真菌数量均远低于国家安全标准。