低氮胁迫对不同青稞苗期生理特征影响和耐低氮性评价

安立昆,姚有华,姚晓华,吴昆仑

(1.青海大学农林科学院,西宁 810016;2.青海省青稞遗传育种重点实验室,西宁 810016;3.国家麦类改良中心青海青稞分中心,西宁 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudumHook.f.),是大麦的变种,是青藏高原历史最悠久栽培最广泛的作物。青稞富含纤维素、蛋白质、β-葡聚糖,是独具高原地方特色的保健食品,也是食品和饲料加工的重要原料,在青藏高原粮食安全和农业经济发展中占有重要的地位[1-3]。青藏高原是青稞的主要产区之一,青藏高原地区气候恶劣,在土壤贫瘠、干旱、低温、强紫外线等多种逆境环境中经过长期的进化和人工培育,产生了种类丰富的青稞资源[4]。

氮元素是作物最重要的营养元素之一,是作物生长发育过程中需求量最大的元素,直接影响作物的产量和品质[5]。在低氮条件下作物的耐低氮性与其产量紧密相关,很多研究表明作物对氮素的吸收和利用存在显著的基因型差异,作物对氮素的利用能力是可遗传性状[6-9]。筛选耐低氮作物品种是提高作物氮利用效率减少氮肥施用最有效途径之一[10]。苗期是进行作物耐低氮性研究的最佳时期之一,在苗期低氮条件对不同作物品种的农艺性状或生理特点进行测定,并进一步筛选耐低氮作物资源已经成为广泛采用的研究方法[11-12]。陈志伟等[12]分别采用正常供氮 (2.0mmol/L NH4NO3)和低氮(0.4mmol/L NH4NO3)的改良Hoagland’s溶液对6种不同基因型的大麦进行培养,并对耐低氮相关性状指标进行研究发现不同基因型大麦对低氮胁迫的耐受能力存在极显著的差异。张锡洲等[13]对16份野生大麦全生育期氮素吸收利用能力进行了研究,发现不同基因型野生大麦在同一低氮水平下其氮素的吸收利用存在显著差异。杨丽娜[14]采用苗期水培的方法以82份西藏野生大麦和16份栽培大麦为材料进行耐低氮品种筛选,发现不同大麦基因型的耐低氮能力具有显著差异,认为发达的根系是大麦耐低氮特性的关键,并筛选出5个耐低氮大麦品种。赵化田等[15]采用水培的方法对46份小麦苗期低氮胁迫下的农艺性状和生理特性进行研究,从中筛选出耐低氮小麦资源15份,并认为采用苗期水培的方法进行不同基因型作物耐低氮研究可以消除不同基因型间固有的生物学和遗传学特性差异,具有速度快,环境条件易控制等优点,能更充分地进行作物耐低氮能力的评价。主成分和隶属函数分析是作物耐低氮性评价中广泛采用的方法。黄兴东[16]对60个谷子品种在低氮条件下的农艺性状和生理指标进行了主成分和隶属函数分析,从中筛选出了2个耐低氮谷子品种。张楚[17]对低氮胁迫下9份苦荞品种苗期农艺性状和生理特征进行主成分和隶属函数分析,筛选出2个耐低氮苦荞品种,并认为优良的根构型和根系生理特性是苦荞耐低氮特性的关键。

目前对大多数作物的耐低氮资源筛选和研究都有广泛而深入的报道,但关于青稞耐低氮资源筛选和生理研究的报道极少。本研究采用苗期水培方法,对低氮培养条件下不同青稞品种苗期生理特性进行研究,为筛选和培育耐低氮青稞品种,减少青稞生产中氮肥的使用奠定了重要的研究基础。

1 材料方法

1.1 试验材料

青稞品种‘康青3号’‘昆仑15’‘黄青1号’‘肚里黄’‘洛隆宗’‘特邬’‘二道眉白青稞’‘昆仑18’由青海省青稞遗传育种重点实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 青稞萌发和培养 选取饱满的青稞种子用84消毒液浸泡6 min后用清水冲洗5次,将种子放在铺有滤纸的培养皿中室温下进行萌发,5 d后选取长势一致的幼苗固定于泡沫板中,每个青稞品种20株幼苗,所有青稞品种放于同一黑色塑料盒(600 mm × 500 mm × 160 mm)中,共设置2盒。采用改良Hoagland’s培养液(80 mg/L NH4NO3)进行培养。每个塑料盒20 L培养液。用空气泵24 h向培养液中通入空气,每3 d更换一次培养液,每天用1 mol/L KOH溶液稳定pH值为7.0。当幼苗生长至3叶期胚乳营养耗尽时,选其中的一盒改用(20 mg/L NH4NO3)改良Hoagland’s培养液进行低氮培养。待青稞生长至5叶期时对生理指标进行测定。

1.2.2 测定指标与方法 生理指标测定:叶绿素SPAD值测定采用日本柯尼卡美能达SPAD-502Plus便携式叶绿素SPAD测定仪测定。选取待测青稞新鲜的叶片和根为样品,参照各参考文献和试剂盒说明书进行处理和测定。采用考马斯亮蓝比色法测定植物可溶性蛋白含量;采用茚三酮比色法测定植物脯氨酸含量[18];采用凯氏定氮法测定植物全氮含量。总蛋白(TP)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)谷氨酰胺合成酶(GS)、硝酸还原酶(NR)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。采用美国赛默飞Multiskan FC酶标仪对各指标进行测定,所有指标均测定3次重复。

1.2.3 数据统计与分析 低氮培养条件下各青稞品种叶和根的总氮、总蛋白、NR酶活性、叶绿素SPAD值、脯氨酸、MDA、SOD、POD、CAT、GS活性的生理指标显著性、变异系数、相关性、主成分和隶属函数分析,参考文献[19-22]等进行计算和分析。利用Microsoft Excel 2019和SPSS 22.0分析处理数据。

耐低氮系数=低氮处理下测定值/正常处理下测定值

变异系数=标准偏差/平均值×100%

隶属函数:μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1,2,3,…,N;

反隶属函数:μ(Xj)=1-(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1,2,3,…,N;(Xj)表示第j个综合指标的隶属函数值;Xj表示第j个综合指标值;Xmax表示第j个综合指标的最大值;Xmin表示第j个综合指标的最小值。

j=1,2,3,…,n;Wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度及权重;Pj为各品种第j个综合指标的贡献率。

2 结果与分析

2.1 低氮胁迫对不同青稞品种幼苗生理指标的影响

利用独立样本T检验比较不同处理方式(正常、低氮)下不同青稞品种中叶和根中总氮、总蛋白、脯氨酸、MDA、叶绿素SPAD、SOD、POD、CAT、NR、GS含量或酶活性变化情况。结果如表1所示,相较于正常培养条件下,低氮胁迫处理后所有青稞品种中叶和根中总氮、总蛋白、NR酶活性和叶绿素SPAD均出现显著下降(P< 0.05)。另外,无论是叶还是根,青稞中脯氨酸、MDA、SOD、POD、CAT、GS含量或酶活性都出现了显著上升(P<0.05)。计算各指标变异系数进一步比较不同处理方式下各指标的波动情况,结果发现叶绿素SPAD、NR活性和GS活性在正常和低氮两组间的变异程度相差较大,说明低氮胁迫下对青稞叶绿素SPAD、NR活性和GS活性影响较大。其余生理指标在正常和低氮两组间的变异程度基本无显著性差异。进一步比较不同生理指标的耐低氮系数变化情况,结果发现NR、POD和GS活性耐低氮指数变异系数较大,说明根NR活性、POD和GS活性对低氮胁迫敏感。根GS活性耐低氮指数变异系数最大可以作为耐低氮指初级筛选指标(表2)。

表1 低氮胁迫对青稞苗期叶和根中的生理指标影响Table 1 Effect of low nitrogen stress on physiological indexes in leaves and root of hulless barely at seedling stage

表2 正常和低氮水平处理下青稞苗期生理指标间的变异Table 2 Variation coefficient of physiological indexes in leaves and roots of hulless barely at seedling stage under normal nitrogen and low nitrogen treatment

2.2 不同供氮水平下青稞资源主成分分析

利用相关性分析探索19个生理指标之间的内在联系,结果如表3所示。从组织类型角度分析发现,叶和根中的生理指标的相关性结果基本一致。19个生理指标中有19对指标之间存在显著相关(P<0.05),27对呈极显著相关(P< 0.01)。相关性结果说明这些生理指标之间在解释青稞耐低氮性信息时存在协同关系。因此,采用主成分分析对青稞品种耐低氮进行综合评价以提取公因子来对原始19个生理指标进行维度划分,进一步筛选能代表青稞耐低氮能力的关键生理指标。主成分分析结果显示特征值排名前三的主成分在解释样本间联系的累计贡献率达到 90.16%,说明可以利用提取的主成分表示原始数据的主要信息。其中第一主成分贡献率 71.99%,叶和根MDA含量的特征向量绝对值远高于其他指标,表明第一主成分主要由叶和根MDA构成,可以总结为细胞膜系统氧化损伤指标因子。第二主成分贡献率为12.35 %,主要由叶和根SOD、POD、CAT活性、总氮、叶绿素SPAD值构成,可以总结为细胞抗氧化酶活性因子。而变异系数分析中POD和叶绿素SPAD耐低氮指数变异系数也较大。第三主成分贡献率为5.82%,同样由叶和根SOD、POD、CAT活性构成,同样可以总结为细胞抗氧化酶活性因子(表4)。公因子提取结果也与相关性结果(表3)结论基本一致:第一主成分MDA与同样被提取出来的第二主成分的几个指标之间存在较强的相关性;第二主成分:POD和SOD酶活、总氮与CAT、SOD和CAT、叶绿素和CAT之间存在相关性,说明这些指标在表征青稞的耐低氮能力中存在协同作用。主成分分析表示MDA和抗氧化酶类活性在评价青稞耐低氮特性中起主导地位,可以作为评价青稞耐低氮能力的重要生理指标。

表3 青稞苗期不同生理指标相对值之间的相关性分析Table 3 Correlation coefficients among low nitrogen stress coefficients of physiological indexes in leaves and roots of hulless barely at seedling stage

表4 低氮处理下青稞苗期叶和根生理指标主成分分析Table 4 Principal component analysis of physiological indexes in leaves and roots of hulless barely at seedling stage under low nitrogen treatment

2.3 不同供氮水平下青稞生理指标的相关性和隶属函数分析值

根据综合得分值利用隶属函数计算隶属值,对8个青稞品系进行模糊隶属函数分析。结果如表5所示,隶属排名平均值越大,说明该品系耐低氮能力越强,具体排序为‘黄青1号’>‘肚里 黄’>‘昆仑15’>‘二道眉白青稞’>‘特邬’>‘洛隆宗’>‘昆仑18’>‘康青3号’。本研究根据各品种隶属值对8种青稞的耐低氮能力进行评估,结果发现‘黄青1号’和‘肚里黄’隶属值大于0.5,说明这两个品种对低氮有更强的耐受能力。‘昆仑15’‘二道眉白青稞’‘特邬’‘洛隆宗’‘昆仑18’和‘康青3号’的隶属值集中为0.243～ 0.415,说明这6个品种对低氮相对敏感。

3 讨 论

农作物对低氮的耐受机制是有一系列非常复杂的生理调控过程,不同基因型作物对低氮耐受机制各有差异。目前很多关于大麦和青稞耐低氮研究大多集中于对低氮条件下的农艺性状进行分析,并且通常选择植株相对干质量作为大麦耐低氮筛选的重要农艺性状指标,关于大麦尤其是青稞中耐低氮筛选相关生理指标的报道极少[12,23-25]。本研究对8种青稞在低氮条件下植株叶片和根中的相关生理指标进行了测定和分析,各青稞品种在低氮处理下各生理指标都出现了明显差异,不同青稞品种对低氮的耐受性表现出了明显差异。