丹润方HPLC 指纹图谱及多成分含量测定研究

吴淑辉，刘 娟，肖 婷，郑慧娥，朱明芳，2*

1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005；2.血管生物学与转化医学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208

丹润方（专利号：201510648346.6）是湖南省中医院朱明芳教授在国家级名中医欧阳恒教授“以皮治皮”理论指导下，结合其近30 年临床工作经验，对多种药物进行反复筛选化裁，最终形成的一种天然中草药面膜[1]，主要由石榴皮、忍冬藤、白芷、乌梅组成，广泛用于痤疮、玫瑰痤疮、黄褐斑及色素沉着性疾病的治疗[2-3]。 现代药理学研究表明，丹润方组成具有抗菌消炎、调节皮脂代谢紊乱、抗氧化、抑制黑色素形成等作用[2，4-5]。 课题组前期研究发现，丹润方可明显降低痤疮患者皮损积分，降低痤疮患者复发率，同时因其具备美白润肤、提亮肤色功效，故名曰丹润[6]。 丹润方为湖南省科技进步奖科技成果转化产品，在湖南省中医院、衡阳市中医院等多家三甲医院广泛应用。然而，目前对于丹润方的质量控制主要集中于各单味药，尚缺乏全方整体性质量控制的方法。中药指纹图谱指中药经适当处理后，采用一定的分析方法得到的能够体现中药整体特性的图谱，能够反映中药多成分特点，整体评价中药质量，确保其内在质量的均一、稳定，可用于中药材、饮片、提取物或中间体、成方制剂的质量控制[7]。 此外，研究表明丹润方酸类成分含量丰富，是其主要的功效成分之一，绿原酸、没食子酸具有抗氧化、抗炎、抗衰老等功效[8-9]；鞣花酸可显著抑制酪氨酸酶活性，具有抗炎、抗衰老、美白等功效[10-11]。 基于此，本研究以丹润方为研究对象，建立其HPLC 指纹图谱，结合化学模式识别技术分析图谱信息，并在同样的色谱条件下测定其3 种有效成分含量，将指纹图谱与多成分定量分析相结合，以期完善丹润方整体质量评价方法，为丹润方的开发与利用提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Agilent 5 TC-C18型色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；JY5002型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；AL204 型万分之一天平、XSR205DU 型十万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SB-3200D 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9145A 型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HH-S8 型数显恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 主要试剂及药物

乙腈（色谱纯，批号：32Y1612PT，美国ASC Grace化工科技有限公司）；甲醇（分析纯，批号：20190328）、磷酸（分析纯，批号：20210220）均购自国药集团化学试剂有限公司；鞣花酸（纯度88.8%，批号：111959-201903）、没食子酸（纯度91.5%，批号：110831-201906）、绿原酸（纯度96.1%，批号：110753-202018）均购自中国食品药品检定研究院。15 批丹润方组成药物均由湖南中医药大学聂孝平教授鉴定，其药物来源见表1。

2 方法与结果

2.1 15 批丹润方浸膏样品制备

对制备的15 批白芷、乌梅、石榴皮、忍冬藤中药饮片进行编号并排序，通过随机数字表法组合出15批全方，制备15 批丹润方样品，见表2。每批按照原处方称取白芷10 g、乌梅10 g、石榴皮10 g、忍冬藤10 g，加入8 倍水浸泡30 min，加热至沸腾，60 ℃保持微沸回流提取30 min，过滤；滤渣加6 倍水加热至沸腾，60 ℃保持微沸回流提取30 min， 过滤合并2次滤液，浓缩至约100 mL，于恒温水浴锅中水浴蒸干后，置真空干燥箱干燥，得丹润方浸膏备用。

2.2 对照品及供试品溶液制备

混合对照品溶液制备：精密称定各对照品适量，加入甲醇，制成含没食子酸、鞣花酸、绿原酸0.400、0.540、0.044 mg/mL 的混合对照品储备液。

供试品溶液制备：精密称定丹润方浸膏0.500 0 g，置具塞锥形瓶中，加入25 mL 60%甲醇，超声30 min，放冷，60%甲醇补足质量，摇匀，过0.45 μm 滤膜，即得。

2.3 色谱条件

采用Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10 min，90% A，10% B；10～25 min，10% A，90% B；25～45 min，12% A，88% B；45～60 min，20% A，80% B；60～65 min，40% A，60% B；65～70 min，50% A，50% B）；流速1.0 mL·min-1；检测波长315 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度考察 随机选取1 批丹润方浸膏，按“2.2”方法制备供试品溶液，连续进样6 次，以峰面积较大、分离度较好的9 号峰作为参照，计算相对保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）范围为0.039%～0.153%，相对峰面积RSD范围为0.293%～4.109%，表明仪器精密度良好。详见表3—4。

表3 丹润方相对峰面积精密度考察

2.4.2 重复性考察 随机选取1 批丹润方浸膏，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.3”项下色谱条件进样，记录色谱图，以峰面积较大、分离度较好的9 号峰作为参照，计算各共有峰的相对保留时间RSD 范围为0.088%～0.378%，相对峰面积RSD 范围为0.125%～6.602%。 详见表5—6。

表5 丹润方相对峰面积精密度考察

表6 丹润方相对保留时间精密度考察

2.4.3 稳定性考察 取同一供试品溶液按“2.3”色谱方法于0、2、4、8、12、24 h 进样，记录色谱图，以峰面积较大、分离度较好的9 号峰作为参照，计算各共有峰的相对保留时间RSD 范围为0.059%～0.551%，相对峰面积RSD 范围为1.534%～5.872%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。 详见表7—8。

表7 丹润方相对峰面积稳定性考察

表8 丹润方相对保留时间稳定性考察

2.5 指纹图谱建立及相似度评价

取S1～S15 批丹润方浸膏样品，按“2.2”项制备相应供试品溶液，按“2.3”色谱条件进样检测，记录色谱图，精密吸取没食子酸、绿原酸、鞣花酸的对照品溶液，按“2.3”项色谱条件进样测定，记录色谱图，标定峰3 为没食子酸，峰10 为绿原酸，峰14 为鞣花酸。 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）进行分析，选定参照图谱后，采用中位数法，时间窗宽度设置为0.3 min，经多点校正后，进行Mark谱匹配，生成丹润方共有模式的对照指纹图谱（图1），共标定丹润方19 个共有峰，15 批样品指纹图谱与对照图谱的相似度为0.938～0.990，各批次间样品相似度均＞0.8（表9），表明各批次相似度较高，所建立的指纹图谱可以较全面地反映丹润方整体成分。

表9 15 批样品指纹图谱相似度

2.6 化学计量学分析

2.6.1 聚类分析 将15 批丹润方共有峰面积导入SPSS 22.0，以组间均连法及平方距离作为度量标准对其进行聚类分析，结果显示，当度量距离为15 时，15 批丹润方可以分为两类：其中S2、S3 为一类，余下批次聚为一类（图2）。 这表明即使在指纹图谱相似度较好的情况下，不同批次药材质量仍存在一定差异。

图2 15 批样品聚类分析

2.6.2 主成分分析 将15 批丹润方共有峰面积导入SIMCA 14.1 软件进行主成分分析，得到15 批丹润方得分图及载荷图（图3—4），从得分图可以看出15 批样品可以分为两类，其中S2、S3 聚为一类，余下聚为一类，与聚类分析结果一致，从载荷图可以看出成分3、12、7、14 对丹润方质量影响较大。

图3 15 批样品得分图

图4 15 批样品载荷图

2.6.3 差异成分分析 为进一步明确对样品分类贡献较大的成分，采用正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）拟合模型，结合变量重要性投影（variable importance projected value, VIP）筛选出导致样品分类影响较大的差异性成分（图5）。 其中具有统计学意义且VIP>1.0 的峰有6 个，按VIP 大小排列为：峰3、峰7、峰12、峰14、峰5、峰1、峰9，其中峰14 为鞣花酸。

图5 VIP 图

2.7 3 种成分含量测定

2.7.1 精密度考察 精密吸取“2.2”项混合对照品溶液，按“2.3”项色谱条件连续进样6 次，记录色谱图，测得没食子酸、绿原酸、鞣花酸峰面积RSD 分别为0.26%、0.34%、0.20%，表明仪器精密度良好。

2.7.2 重复性考察 随机选取1 批丹润方浸膏，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.3”项下色谱条件进样，记录色谱图，测得没食子酸、绿原酸、鞣花酸峰面积RSD 分别为0.16%、0.37%、0.28%。2.7.3 稳定性考察 取同一供试品溶液按“2.3”色谱方法于0、2、4、8、12、24 h 进样，记录色谱图，测得没食子酸、 绿原酸、 鞣花酸峰面积RSD 分别为0.18%、0.09%、0.35%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7.4 线性关系考察 取适量“2.2”制备的混合对照品储备液，过0.45 μm 滤膜，精密吸取混合对照品1、2、4、6、8、10 μL，按“2.3”项色谱条件进样分析。 以对照品溶液质量为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 详见表10。

表10 3 种成分线性方程

2.7.5 加样回收实验 精密称定6 份已测定指标成分含量的样品各0.500 0 g，加入各对照品适量，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.3”项下色谱条件进样，记录各色谱峰峰面积，计算得到的平均加样回收率分别109.73%、102.02%、101.88%。RSD 分别为1.01%、0.52%、0.27%。

2.7.6 样品含量测定 取S1～S15 批丹润方浸膏样品，按“2.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.3”项下色谱条件进样，记录色谱图，根据标准曲线计算样品中各成分质量分数，结果见表11。

表11 15 批丹润方各成分质量分数

3 讨论

丹润方由石榴皮、忍冬藤、白芷、乌梅组成。 石榴皮，味酸涩，《本草撮要·果部》记载其“入手太阴足少阴经”，可“涂疮拔毒”，亦有记载其“入手阳明大肠”，肺与大肠相表里。 《医学启源·肺之经》云：肺之经“外养皮毛，内荣肠胃，与大肠为表里，手太阴（阳明）是其经也”，肺在体合皮，其华在毛，皮肤病多可责之于肺，选用入肺经之药能直达病所[12]。 “药之为枝者达四肢，为皮者达皮肤”，基于“同气相求”原理，选用动物或植物的皮部入药，相互感应，奏“以皮达皮”“因病在皮，以皮行皮”“以皮治皮”之效[13]。 忍冬藤，又名金银花藤，味甘，性寒，归肺、胃经，具有清热解毒、消红活血、通络散结的功效，是外用的良药。白芷，“长肌肤，润泽颜色，可作面脂”，具有润泽颜面、祛斑增白之功效[14]。 乌梅，味酸，性温，归肝、脾、肺、大肠经，可“去青黑痣”。 四药相伍，共奏活血行气通络之功，起润泽颜面、祛斑美白之效。 现代药理学研究表明，丹润方主要由黄酮类、有机酸类、多酚类组成[15-17]，其中，没食子酸、绿原酸、鞣花酸等酸类成分具有抗氧化、抗衰老、抗炎等药理作用，可作为天然氧自由基清除剂应用于化妆品中[16，18]。 研究显示，鞣花酸可清除自由基，参与抗氧化防御相关酶的表达、 增强抗氧化酶活性及基因表达来达到抗氧化目的[19]；此外，鞣花酸能抑制酪氨酸酶，从而减少黑色素的形成[20]。没食子酸，可阻止自由基对脂肪酸分子中双键的进攻来发挥抗氧化作用[21]。 绿原酸则可通过抑制脂质过氧化，上调过氧化物分解酶活性，发挥抗氧化作用[22]。

由于丹润方化学成分复杂，部分化学成分结构相似，色谱峰易重叠，增加了指纹图谱的建立难度，为使丹润方各组分成分较好分离，在指纹图谱的建立过程中，综合考虑图谱信息量、色谱峰响应和分离效果，考察了安捷伦Agilent 5 TC-C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、依利特Supersil ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridge R○C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）对丹润方色谱图的影响，结果表明，安捷伦Agilent 5 TC-C18（2）色谱柱峰形对称、分离度较好、稳定性较好，故本研究选用Agilent 5 TC-C18（2）色谱柱。 同时，考察了280、315、323、327、350、360 nm 不同波长及不同流动相甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液对丹润方色谱图的影响，结果表明以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，检测波长为315 nm 时，各色谱峰分离效果较好，峰形较好，且基线较为平稳。

中药多指标成分整体质量控制已成为中药质量控制的必然发展趋势[23]，中药指纹图谱能够反应方剂所含成分，可揭示成分的特征性、溯源性及可测性，具有整体性与动态性的特点，是一种有效的质量评价方法[24]。 本研究构建了15 批丹润方HPLC 指纹图谱，发现共有峰19 个，15 批样品指纹图谱与对照图谱的相似度为0.938～0.990，各批次间样品相似度大于0.9，提示不同批次丹润方整体质量较稳定。通过聚类分析、主成分分析等化学计量学分析发现，15批丹润方可以大致分为两类，这表明不同批次共有成分存在一定差异，影响各批次间差异的主要峰有峰3、峰7、峰12、峰14、峰5、峰1、峰9，其中峰14为鞣花酸，这可能与不同产地药材的含量差异有关。此外，本研究建立了没食子酸、绿原酸、鞣花酸3 种有效成分的含量测定方法，将指纹图谱与多成分定量分析相结合，可为丹润方质量评价的整体性及准确性提供科学依据。