补肾活血方对内源性“筋伤”腰椎失稳兔模型的影响

蔡楚豪，展嘉文，韩 涛，谢 瑞，张伟业，王戈文，朱立国*

1.北京中医药大学，北京100015；2.中国中医科学院望京医院，北京 100015；3.北京中医医院顺义医院，北京 101300

退行性腰椎失稳（degenerative lumbar spinal instability, DLSI）是导致下腰痛（low back pain, LBP）的常见疾病，患者以反复发作的腰痛，时常伴有局部酸胀无力，伴或不伴下肢放射痛为主要临床症状。该病病程迁延难愈，对患者身心健康及生活质量造成负面影响，是导致中老年人活动障碍的常见原因[1-3]。据全球疾病负担研究结果显示[4]，在所调查的204个国家范围内，369 种疾病中，LBP 是导致全球负担升高的10 个关键病种之一，发病年龄呈年轻化趋势。有研究表明，80%的成年人曾受到腰痛的困扰[5]。 流行病学调查显示，30%的腰痛与腰椎失稳相关[6-7]。随着我国人口逐渐老龄化，DLSI 将带来巨大的经济和社会负担。

近年来，国内外对于DLSI 的研究投入逐渐增加，在该病影像学、病理学、生物力学、诊断学及治疗学等领域的相关研究正在逐步深入开展[8-13]。现代研究普遍认为，人体脊柱稳定性由两大部分组成：一是内源性稳定，包括椎体、附件、椎间盘、韧带，维持静力平衡；二是外源性稳定，主要由肌肉调节和控制，是脊柱活动的原动力，维持着脊柱的动力平衡[14]。《素问·痿论》指出：“宗筋主束骨而利关节也。”“筋”的理论体系对中医骨伤科发展有着重要意义，相关理论与现代医学对人体脊柱稳定系统的认识相类似。 “筋，肉之力也”“诸筋者皆属于节”，筋的主要功能为连属关节，络缀形体，主司关节运动。由此可见，脊柱相关结构中的关节突、关节囊、韧带以及肌肉均发挥着“筋”的作用，维持着脊柱的稳定与运动。中医学认为，肝藏血，主疏泄，在体合筋。 肾藏精，肝肾同源，精血同源，“筋”发挥正常功能赖于精血的濡养，而肝以血为体，以气为用，气帅血行，使血脉通利，不滞不瘀，才能濡养筋骨肌肉。本研究团队前期以肾虚血瘀立法，根据古方青娥丸加减形成的补肾活血方，在临床中治疗腰痛类疾病取得了较好疗效[15]，并且通过网络药理学初步探讨了补肾活血中药治疗DLSI 的作用机制[16]。因此，本实验探究补肾活血方对内源性“筋伤”腰椎失稳的影响，以期为该病的治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物

体质量为2.5～3.0 kg，4～6 月龄，健康新西兰兔33 只，雌雄混合，单独饲养于北京市昌扬西山养殖场，许可证号：SCXK（京）2021-0008。 自由饮食水及饲料，环境温度为20～25 ℃。

1.2 主要药物、试剂与仪器

补肾活血方药物组成：杜仲15 g，补骨脂10 g，怀牛膝10 g，丹参12 g，威灵仙10 g，木瓜9 g。 按照补肾活血方原方用量制备药液（由中国中医科学院望京医院中药房提供）。

伊红（批号：MD23021607）、苏木素染液（批号：MD23021607）、TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（批号：MD23032511）均购自北京百奥思科生物医学技术有限公司。

石蜡切片机（型号：RM2235）、加热石蜡包埋系统（型号：G1150 H）均购自北京百奥思科生物医学技术有限公司。

1.3 分组与造模

取22 只健康新西兰兔，根据施杞等[17]与张鹏等[1]报道的实验方法，进行韧带损伤型“筋伤”腰椎失稳动物模型手术，暴露出L2～L6 棘突和腰背最长肌，用刀柄沿椎板向两边将肌肉分开，暴露出L2～L6 椎板，用小组织剪或手术刀切除L2～L6 棘上韧带、棘间韧带，切除关节突关节的部分关节囊，造模动物出现椎体水平位移的数值增大、椎间高度指数（disc height index, DHI）减小，提示造模成功[11]。 造模后的新西兰兔按照随机数字表法分为模型组、补肾活血方组，每组11 只。另取11 只健康新西兰兔行造模手术相同的皮肤切口后立即缝合，为假手术组。术后对实验兔按每千克体质量20 U 给予青霉素，每日肌内注射1 次，连续注射5 d。

1.4 给药方案

根据标准动物剂量折算表计算（相当于临床等效剂量）：动物每日用药量=成人每日用药量/正常成人体质量×换算常数×校正系数[18]，参照课题组前期实验给药方案，补肾活血方组新西兰兔按生药3.597 g·kg-1·d-1灌胃[19]，每日给药1 次，自造模后连续给药8 周。 模型组与假手术组按同法灌服等体积的生理盐水。

1.5 观察指标

1.5.1 影像学指标 分别于术前、术后4 周、术后8周每组取4 只实验兔，进行影像学X 线摄片。 用实验兔固定装置固定实验兔头部，拍摄腰椎正、侧位X线片，进行椎体水平位移及DHI 测量。

（1）椎体水平位移测量

在侧位X 线片上，应用Mimics 医学影像控制系统，测绘L1～L7 椎体水平位移，即上位椎体后下角至下位椎体后缘连线的垂直距离（如图1A、B）。

图1 腰椎影像学指标测量示意图

（2）DHI 测量

根据AKEDA 等[20]提出的DHI 计算公式，DHI=（椎体间前侧高度+椎体间后侧高度）/（上位椎体下缘宽度+下位椎体上缘宽度），如图1C 所示。 在实验兔X 侧位片上，应用Mimics 医学影像控制系统进行L1/2～L7/S1 椎间盘相关数据参数测量，并计算DHI，作为反应具体椎间隙高度的指标（图1D）。

1.5.2 病理学检测

（1）HE 染色

于第4、第8 周随机取各组实验兔3 只，空气栓塞处死后，取出腰段脊柱，切割、修整后得到完整椎间盘组织，进行HE 染色。固定椎间盘组织，脱钙，乙醇浓度阶梯依次脱水，使用二甲苯溶液进行透明。将浸蜡后的组织包埋于石蜡中，切片、铺片。贴片、烘片，脱蜡。 苏木精染细胞核，伊红染细胞质。 脱水封片，显微镜观察，最后进行图像采集分析。

（2）TUNEL 染色

于第4、第8 周随机取各组实验兔3 只，空气栓塞处死后，取出腰段脊柱，切割、修整后得到完整椎间盘组织，进行TUNEL 染色。脱蜡，蒸馏水洗脱。于37 ℃蛋白酶K 中孵育，洗涤蛋白酶K。 加入TUNEL反应液，37 ℃避光孵育，洗涤反应液。用抗荧光淬灭封片液封片后，于荧光显微镜下观察。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组椎体水平位移比较

与假手术组比较，模型组、补肾活血方组第4、第8 周椎体水平位移明显增大（P＜0.05）；与模型组比较，补肾活血方组第8 周椎体水平位移明显减小（P＜0.05）。 详见表1。

表1 各组椎体水平位移比较（±s，n=4，×10-2 mm）

表1 各组椎体水平位移比较（±s，n=4，×10-2 mm）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组模型组补肾活血方组术前42.44±14.30 39.66±12.53 39.30±15.32第4 周41.28±16.23 63.42±17.11*63.52±22.43*第8 周46.01±18.45 102.26±31.72*81.50±23.81*#

2.2 各组DHI 比较

与假手术组比较，模型组第4、第8 周DHI 明显减小（P＜0.05）；与模型组比较，补肾活血方组第8 周DHI 明显增大（P＜0.05）。 详见表2。

表2 各组DHI 比较（±s，n=4，%）

表2 各组DHI 比较（±s，n=4，%）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组模型组补肾活血方组第0 周36.18±3.25 35.87±2.86 35.95±3.58第4 周36.12±6.27 33.03±3.63*35.21±3.54第8 周34.12±3.84 29.66±3.02*32.83±3.84#

2.3 各组椎间盘组织细胞凋亡率比较

与假手术组比较，第4、第8 周模型组、补肾活血方组椎间盘组织细胞凋亡率明显增大（P＜0.05）；与模型组比较，第4、第8 周补肾活血方组椎间盘组织细胞凋亡率明显减小（P＜0.05）。 详见表3、图2。

表3 各组椎间盘组织细胞凋亡率比较（±s，n=3，%）

表3 各组椎间盘组织细胞凋亡率比较（±s，n=3，%）

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05。

组别假手术组模型组补肾活血方组第0 周36.58±7.55 36.58±7.55 36.58±7.55第4 周31.26±0.16 55.98±1.32*47.8±3.19*#第8 周40.33±6.25 63.24±1.53*52.1±2.12*#

图2 第0、第4、第8 周时各组椎间盘组织TUNEL 染色图片（×400）

2.4 各组HE 染色结果

第4 周时，假手术组椎间盘相对完整，形态正常，纤维环排列规整，髓核含丰富的软骨细胞，基质中可见大液泡；模型组可见纤维环排列紊乱；补肾活血方组较模型组纤维环排列更规整。第8 周时，随着自然退变，假手术组椎间盘组织切片标本可见纤维环排列存在一定程度的紊乱；模型组椎间盘纤维环退变较其他两组更明显，纤维环排列紊乱且存在缝隙，髓核皱缩，基质较少；补肾活血方组与模型组比较，纤维环裂隙较少，与髓核交界区更清楚，髓核基质更多。 详见图3。

图3 第4、第8 周时各组实验兔椎间盘HE 染色图（×100）

2.5 各组腰椎侧位片观察

观察对比各组第4 周拍摄的X 线片，未见明显差异。 对比第8 周X 线侧位片，与假手术组相比，补肾活血方组、模型组均有明显的骨质增生，可见一定的椎体滑移表现，模型组可见椎间隙变窄。 详见图4。

图4 第4、第8 周时各组实验兔腰椎侧位X 线片

3 讨论

DLSI 的主要临床症状为腰痛或下肢疼痛，属于中医学“腰痛”“腰痹”等范畴。随着年龄增加，肝肾亏虚，或长期劳伤，或外邪侵袭等，出现局部气血瘀滞，筋骨失衡，从而产生疼痛与失稳。其中肾虚为关键病机。中国中医科学院望京医院朱立国教授根据《太平惠民和剂局方》中的青娥丸，结合自身临床经验加减化裁，形成补肾活血方，全方补肾助阳、强筋健骨、活血通络，标本兼治，用于治疗临床肾虚血瘀型腰痛。方中盐杜仲为君药，其性温，助阳补虚，主入肝肾二经，可补肝肾、强筋骨。 臣药为补骨脂与牛膝，一方面辅杜仲补肾温阳，补骨脂辛热香燥，苦甘并存，能补能涩，强腰固精，能治风冷侵袭之腰膝冷痛；另一方面，助君药发挥补肝肾、强筋骨之功效，且牛膝归肝肾二经，可治腰膝酸痛、筋骨无力，亦可活血化瘀、通经止痛。 佐使药丹参、威灵仙、木瓜，丹参可佐助牛膝活血化瘀，其性微寒，避免全方一味温补；威灵仙辛散温通，性猛善走，通行十二经脉，通络止痛，驱散风湿外邪；木瓜舒筋活络，驱散风湿外邪。

目前普遍认为，椎间盘的变性与腰椎不稳直接相关，椎间盘变性是腰椎不稳的诱发因素[21]。本研究结果显示，补肾活血方组椎间盘组织细胞凋亡率在第4、第8 周均低于模型组。 椎间盘内大量的细胞凋亡可使椎间盘内环境的平衡被破坏，加速椎间盘退变的进程[22]。在第8 周时，补肾活血方组椎体水平位移较模型组更小，DHI 较模型组更高。椎间盘退变是导致腰椎失稳的重要病理因素[23]，一定程度的椎间盘高度下降使椎间关节以及韧带松弛，失去维持稳定的必要张力，会导致椎体滑移和动力不稳[21]。综合实验结果，认为补肾活血方干预可延缓内源性“筋伤”腰椎失稳新西兰兔模型的退变失稳进展。

本研究在模型的建立上存在不足，兔作为四足行走的哺乳动物，脊柱节段在数量和结构方面与人体有着一定差异，人类脊柱相关的腰痛症状的发生，与直立行走活动时，腰椎受到的应力刺激有关。 有研究[24]设计了无创性脊柱轴向加压的方法来建立实验兔椎间盘退变模型，在今后腰椎失稳相关的实验研究中，建立动物模型时可与之合理结合，加以创新，使模型更接近人类腰椎退变情况。本实验研究主要采用破坏韧带等组织结构，即破坏静力平衡的方式，造成实验兔腰椎失稳的模型。 今后可行进一步实验，增设破坏脊柱动力平衡的分组，对比观察补肾活血方对其的影响。