玉米接种丛枝菌根真菌后对土壤铅污染的耐受效应

杨怡森,孙晨瑜,马俊卿,覃圣峰,周勋波,3,黄京华,3①

(1.广西大学农学院,广西 南宁 530004;2.广西高校作物栽培学与耕作学重点实验室,广西 南宁 530004;3.广西大学植物科学国家级实验教学示范中心,广西 南宁 530004)

土壤中的超量汞、镉、铬、铅等重金属导致农田作物生长受到影响[1-2]。重金属污染导致的作物产量和品质降低所造成的经济损失每年可达200亿元[1-2]。重金属胁迫下玉米的根系活力降低,光合能力减弱,鲜重下降,且在高浓度铅胁迫下会使籽粒蛋白质和氨基酸含量减少,同时贮存在籽粒中的铅通过食物链进入人体富集后使免疫、循环系统受损,影响人体健康[3]。因此,如何有效修复重金属污染土壤,保证作物正常生长及人体健康,这些问题日渐受到关注并亟待解决。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)能与植物根系建立共生体系,形成地下菌丝网络[4],使土壤中部分重金属被固定在真菌体内,从而降低重金属对植物的毒害作用[5]。此外,AMF与植物共生可增加根系长度、表面积及直径[6],促进其对氮、磷、钾等矿物元素的吸收[7],提高植物叶绿素含量、光合速率、蒸腾速率等光合生理指标以及植物抗氧化酶活性[8],使植物的生物量增加,促进植物生长,因此菌根-植物联合修复现已成为热门研究方向。

玉米属于C4代谢作物,具有适应性好、抗逆性强、应用价值高等特点,在我国南北方皆可种植。故可采用玉米-丛枝菌根真菌来改善重金属污染土壤。由于农田污染土壤重金属种类较为复杂,无法对单一重金属进行研究,因此采用盆栽方法模拟种植。目前,模拟土壤重金属污染的研究多通过外源添加方式进行[9],而矿区农田污染土壤中的重金属经长期干湿交替并与土壤多种化合物结合,使重金属有效性降低,因此对植物的毒性也与外添加不同[10],使得土壤老化与否对接种AMF的植物毒害效果有较大差异。未进行土壤老化的试验结果无法准确模拟矿区污染土壤接种AMF的效果。因此,笔者先对土壤中外源添加的Pb(NO3)2老化,之后以盆栽的方式研究不同浓度铅污染条件下接种AMF对玉米生长生理及抗逆性的影响,为菌根-植物联合修复污染土壤提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验设计

玉米(“桂单0810”)由广西农科院玉米研究所育成提供。供试菌种(内生菌根):地表球囊霉(Glomusversiforme,Gv)由青岛农业大学提供;摩西管柄囊霉(FunneliformismosseaeNM02A,Fm)、幼套近明球囊霉(ClaroideoglomusetunicatumHEB04和HEBN02A混合,Ce)购自中国丛枝菌根真菌种质资源库(BGC),以玉米做宿主扩繁所得菌沙中孢子密度约为80个·g-1。

试验设置4个土壤铅含量:0、170、570、970 mg·kg-1,每个含量下设单接种AMF(Fm、Gv、Ce)和不接种(NM)处理,每个处理重复3次。

基质(2 kg·盆-1)为土壤和河沙(质量比1∶1)的混合物。土壤取自广西大学农学院试验田(22°51′15″ N,108°18′4.9″ E),河沙购于当地建材市场。土壤与河沙经过筛、灭菌后备用。土壤pH值为7.4,w(速效氮)为32.6 mg·kg-1,w(有效磷)为15 mg·kg-1,w(有机质)为16.9 g·kg-1。原始土壤w(铅)为30.6 mg·kg-1,每盆基质中加40 mL不同浓度的Pb(NO3)2溶液,老化15 d后每盆加40 g菌沙(约3 200个孢子),对照组加等量灭菌的菌沙,播种2颗玉米。每周浇50 mL霍格兰营养液,1周后间苗至1株·盆-1,至抽雄期(生长65 d)取样待测。

1.2 测定指标与方法

1.2.1农艺性状

株高用直尺测量;叶绿素含量用叶绿素仪(CCM-300,美国OPTI-science公司)测定;植株鲜重先取样洗净,吸干水分后从茎基部剪下根系,分别测定地上和地下部鲜重。

1.2.2菌根侵染率

取20个1 cm的根段,用墨水醋酸染色法进行染色观察,测定菌根侵染率[11]。

1.2.3生理生化指标

采用氮蓝四唑光还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;愈创木酚-过氧化氢法测定过氧化物酶(POD)活性;紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性;磺基水杨酸法测定脯氨酸含量;考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量;硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛(MDA)含量[12]。

1.2.4植株铅含量

铅含量参照GB 5009.268—2016用ICP-MS测定[13]。

1.3 数据处理

采用Excel 2016和SPSS 23.0软件进行数据统计分析,采用单因素方差(one-way ANOVA)进行差异显著性分析(α=0.05),并用Origin 2021作图,图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同施铅含量下玉米根系的菌根侵染率

施铅促进AMF与玉米根系共生,除接种Fm的玉米菌根侵染率在施铅含量大于170 mg·kg-1后随施铅含量的升高而降低外,其余2种接菌处理的菌根侵染率均随施铅含量的升高而增加,但在施铅含量大于170 mg·kg-1后菌根侵染率增幅减少(图1)。接种Fm、Ce、Gv相比无铅污染处理侵染率分别提高15%～25%、32%～36%和17%～23%。

NM—对照,Fm—接种摩西管柄囊酶,Ce—接种幼套近明球囊酶,Gv—接种地表球囊酶。

2.2 不同施铅含量下接种AMF对玉米生长的影响

随施铅含量的提高,NM组玉米的株高和鲜重先增后降,在施铅含量为970 mg·kg-1时受到抑制;相比同含量NM处理,AMF和玉米共生使玉米茎叶、根系鲜重均显著高于同含量下NM处理,增加量达50%,表明接种AMF对铅胁迫有缓解作用。在施铅含量为170 mg·kg-1时,仅接种Fm可显著提高叶绿素含量;在施铅含量为570 mg·kg-1时接种AMF均显著提高叶绿素含量,说明AMF共生能使叶绿素含量维持在较高水平(图2)。

NM—对照,Fm—接种摩西管柄囊酶,Ce—接种幼套近明球囊酶,Gv—接种地表球囊酶。

2.3 不同施铅含量下接种AMF对玉米茎叶、根系铅含量的影响

在施铅含量为0 mg·kg-1时玉米体内未检测到铅。AMF和玉米共生显著降低茎叶铅含量,在施铅含量为570和970 mg·kg-1时茎叶铅含量降低50%(图3)。相比NM处理,当施铅含量为170 mg·kg-1时接种AMF使根系铅含量显著增加44.21%～405.24%;在施铅含量为570和970 mg·kg-1时接种Fm、Ce后,根系铅含量分别降低31.56%和53.71%(图3)。计算转移系数发现,同一施铅含量下接种AMF显著降低玉米体内铅的转移系数,抑制铅向地上部转移,降低对玉米的毒害。

NM—对照,Fm—接种摩西管柄囊酶,Ce—接种幼套近明球囊酶,Gv—接种地表球囊酶。同一组直方柱上方英文小写字母不同表示

2.4 不同施铅含量下接种AMF对玉米抗氧化能力的影响

2.4.1接菌对玉米MDA含量的影响

随着施铅含量的升高,NM组玉米叶片、根系MDA含量不断增加(表1)。相同施铅含量下接种AMF的玉米叶片、根系MDA含量增加。但在施铅含量为170 mg·kg-1时,相比同含量NM处理,接种Fm、Gv使叶片MDA含量分别降低24.4%和53.9%。施铅含量为970 mg·kg-1时接种Fm后叶片MDA含量显著降低45.2%,说明接菌在该条件下缓解细胞膜脂过氧化程度。接种AMF后根系中的MDA含量则显著增加,其中接种Gv增加最多。相比未接菌处理,在施铅含量为0、170、570和970 mg·kg-1下接种AMF处理,玉米MDA含量分别显著增加157.6%、100%、151.5%和57.6%,表明接菌未减轻根系膜脂过氧化程度。

表1 不同施铅含量下接种AMF后玉米体内丙二醛含量

2.4.2接菌对玉米抗氧化酶活性的影响

在施铅含量为0 mg·kg-1时接种Fm和Gv显著减低叶片SOD活性。铅污染条件下,接种Ce、Gv显著减低叶片SOD活性(图4)。随着施铅含量升高,NM组中根系SOD活性在970 mg·kg-1时下降。相比相同施铅含量NM处理,玉米与菌根共生显著提高根系SOD活性,在施铅含量为970 mg·kg-1时接菌效果最佳,说明施铅含量高时接菌对提高根系抗胁迫的作用更显著。

NM—对照,Fm—接种摩西管柄囊酶,Ce—接种幼套近明球囊酶,Gv—接种地表球囊酶。

随着施铅含量增加,NM组中玉米叶片POD活性在170 mg·kg-1下增加,570、970 mg·kg-1降低;相比相同施铅含量NM处理,玉米与菌根共生显著提高叶片POD活性。随施铅含量增加,NM组中玉米根系POD活性在170 mg·kg-1时受抑制;相比相同施铅含量NM处理,接种AMF显著提高根系POD活性,但施铅含量为970 mg·kg-1时接种Gv后POD活性下降。

相比相同施铅含量NM处理,接种AMF提高叶片CAT活性。随着施铅含量增加,NM组中根系CAT活性在170、570 mg·kg-1时降低,970 mg·kg-1时增加。相比相同施铅含量NM处理,在施铅含量为570 mg·kg-1时接种AMF后CAT活性显著提高,970 mg·kg-1时仅接种Ce后CAT活性显著提高。

2.5 接菌对玉米脯氨酸和可溶性蛋白含量的影响

脯氨酸和可溶性蛋白是参与玉米渗透调节的重要物质。随着施铅含量升高,NM组中叶片、根系脯氨酸含量降低。相比相同施铅含量NM处理,接种AMF使叶片脯氨酸含量下降0.8%～37.5%(表2)。相比相同施铅含量NM处理,在0和570 mg·kg-1下接种AMF使根系脯氨酸含量分别显著降低9.0%～21.6%、14.2%～20.1%。

表2 不同施铅含量下接种AMF的玉米体内脯氨酸含量

随着施铅含量增大,NM组中叶片、根系可溶性蛋白含量先增加后降低。相比相同施铅含量NM处理,接种Ce和Gv增加叶片可溶性蛋白含量(表2)。相同施铅含量下接种AMF可显著增加根系可溶性蛋白含量(141.8%～660.8%),增强根系的保水能力,但随施铅含量的升高,可溶性蛋白增加量有所降低,说明施铅含量的增加抑制了AMF的作用。

3 讨论

农田土壤中重金属含量过高会对作物生长产生明显毒害作用,其中铅具有毒性强、污染面积大等特点,被认为是我国土壤污染的主要污染物之一[14]。研究发现铅胁迫下植物株高、干鲜重下降,抗氧化系统受损,抑制植物生长[15]。EKMEKÇI等[16]研究发现,外源施加Pb(NO3)2为414 mg·kg-1时便可抑制植株生长,降低玉米干重和根茎长度。笔者研究中,外源Pb(NO3)2老化后在铅含量达到970 mg·kg-1时对玉米株高、鲜重产生抑制。植物机体受到胁迫等伤害时通过SOD、POD、CAT等抗氧化酶转化体内应激产物如H2O2和O2·-等为无毒或低毒的物质,降低对植物的损伤[17]。外源铅胁迫(100 mg·kg-1)导致玉米根系和叶片中抗氧化酶活性比对照降低50%[18],而在该试验中玉米叶片POD、CAT活性在施铅含量为970 mg·kg-1时受到抑制,这是由老化后土壤铅的有效性降低所致。

丛枝菌根真菌通过菌丝体和孢子来束缚重金属向植物地上部转移,此外AM菌丝可促进土壤有机物的释放,借助AMF和微生物所建立的复杂微生物菌根网络,植株根际土壤的细菌等微生物丰度得到提高,促进微生物的代谢和土壤养分循环[19],提高植物根系对土壤养分吸收,增强对重金属胁迫的抗性,进而促进植物生长[20]。重金属胁迫下接种根内球囊霉(Rhizophagusintraradices,Ri)显著提高玉米生物量,同时增强玉米根系对重金属的固持效果,降低重金属对玉米的毒害作用[21]。试验发现在施铅含量为570、970 mg·kg-1下菌根共生时,在丛枝菌根真菌的菌丝体和孢子的作用下茎叶铅含量降低,根系铅含量增加,抑制铅往地上部转移,降低对玉米毒害,这与前人研究结果[22]一致。铅污染条件下接种AMF使玉米叶片叶绿素含量增加3.9%～15.3%,光合作用增强,玉米株高和生物量显著提高,促进玉米生长,这与张春楠等[23]研究结果基本一致。

接种AMF能不同程度提高植物抗氧化能力,铅胁迫下接种Fm和Ri对刺梅(Robiniapseudoacacia)叶片SOD活性有促进作用,但MDA含量却降低,POD含量无显著变化[24]。YANG等[25]发现铅胁迫下接种Fm增加玉米叶片的SOD和CAT含量,该试验同样发现接种Fm、Ce、Gv可提高玉米SOD、POD、CAT活性,增强其对活性氧的清除能力,保证细胞正常生长,但在 970 mg·kg-1下接种Fm和Gv使CAT活性下降,仅接种Ce提高CAT活性,可能是高浓度铅污染使玉米根系受损的同时影响菌根生长,因而未能起到促进作用。

植物吸收重金属使体内MDA含量增加,细胞膜脂过氧化程度加剧[26]。笔者试验中,接种AMF后玉米体内MDA含量居高不下,可能是因为接菌后菌根从玉米体内夺取养分,加剧玉米细胞的受损状况,因此MDA含量增加。

脯氨酸和可溶性蛋白是玉米渗透调节的重要贡献者,接菌并未降低玉米体内脯氨酸含量,但可溶性蛋白含量比不接菌植株显著增加,可溶性蛋白的增加使玉米渗透调节能力增强,提高保水能力,保证细胞中各生化反应的正常进行,提高玉米对重金属的耐性,这与SHENG等[27]研究结果一致。

4 结论

外源施加Pb(NO3)2经过老化后对玉米毒性降低,只有w(铅)较高(970 mg·kg-1)时才对玉米生长造成胁迫作用,玉米生长受到明显抑制。铅污染条件下,菌根侵染率提高,菌根共生显著提高土壤铅污染条件下玉米的株高、鲜重及叶绿素含量,降低铅转移系数,缓解铅对玉米的损伤,促进玉米的生长;铅污染条件下玉米抗氧化能力降低,而接种AMF通过提高玉米叶片和根系SOD、POD、CAT活性及可溶性蛋白含量,提高抗氧化和保水能力,从而增强玉米对重金属铅污染的抗性,保证其在铅污染土壤中的正常生长。试验发现土壤老化后,仅在铅含量为970 mg·kg-1时对玉米产生一定的抑制作用,因此后续试验中需提高铅含量,以确定玉米接种AMF后所能承受的最大铅胁迫浓度,为AMF在污染农田的使用提供依据,了解接种AMF对土壤微生物的影响,同时从分子角度研究接菌后不同生理指标产生变化的原因,以揭示铅胁迫下丛枝菌根真菌共生提高玉米抗性的机制。