茉莉酸甲酯对水稻纹枯病的诱导抗性及防御酶活性影响的研究

黄俊宝，陈立才，曹中盛，孙滨峰，李艳大

（江西省农业科学院 农业工程研究所/江西省农业信息化工程技术研究中心，江西 南昌 330200）

水稻纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctonia solaniKühn）引起的一种世界性土传真菌病害，随着矮秆多蘖品种的密植、高肥、高产栽培技术的推广和管理方式的改变，纹枯病的发生日趋严重，严重时产量损失超30%，严重威胁着我国水稻生产的安全［1］。当前，水稻抗纹枯病育种至今未发现对其免疫的资源材料，缺少高抗品种［2］，其防治措施仍以高效、快速、简便的化学防治为主［3］，但不合理使用化学农药所导致的环境污染、农药残留、抗药性问题日益突出［4-5］。近年来，比较热门的纹枯病生物防治虽然具有安全、无残留、无抗药性、环境兼容性好等优点［6］，且已筛选到具有明显防治效果的生防菌［5-9］，但其防效较慢，防治技术要求高，易受环境因素的影响，且难以应对突发性病虫害［10］，因而其实际应用受到限制。因此，寻找更适宜的防治方法来控制水稻纹枯病显得更为迫切。

植物诱导抗病性是植物抵御病害侵染的重要机制［11］，利用激发子可激活作物自身免疫系统，诱导作物产生系统、持久和广谱的抗病性，为作物病害的绿色防治提供了新思路。茉莉酸类物质（Jasmonates, JAs）是植物诱导抗病研究领域应用较广的一种高酶活性激发子［12］。研究表明，外源MeJA能提高植物过氧化物酶（Peroxidase,POD）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalnaine Ammonialyase, PAL）、多酚氧化酶（Polyphenoloxidase, PPO）、抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase, APX）等防御酶活性，显著地减轻了巴西烟草病毒病［13］、稻瘟病［14］、水稻白叶枯病［15］、辣椒青枯病［16］等作物病害的发生，但关于MeJA诱导水稻抗纹枯病效应的研究较少。为进一步探索MeJA诱导水稻抗纹枯病的效应，本研究拟以菌丝生长速率法测定MeJA对水稻纹枯病菌丝的抑菌效果，以外源MeJA喷施处理水稻幼苗的方式测定水稻纹枯病病情指数，筛选出具有较好诱抗效果的MeJA浓度，并测定适宜浓度的MeJA喷施诱导处理对水稻防御酶活性的影响，以期为绿色防控水稻纹枯病提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试水稻品种：中嘉早17，其种子经消毒催芽后播种于塑料盆中，培养至4叶1心期。

水稻纹枯病菌：AG1-IA菌丝融合群，由江西农业大学植物病理实验室提供。

PDA培养基：称取去皮马铃薯200 g切成小块，加蒸馏水1000 mL煮沸20~30 min，用纱布过滤后补加蒸馏水至1000 mL，加入葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，加热溶化后分装，121 ℃高压灭菌20 min。

茉莉酸甲酯：购自美国Merck公司，以少量二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）溶解，再用含0.1% Tween-80的蒸馏水配成10.00 mmol/L溶液备用。

1.2 试验方法

1.2.1 MeJA对水稻纹枯病菌丝生长的影响 采用菌丝生长速率法测定MeJA对水稻纹枯病菌丝生长的影响。MeJA设置7个浓度，分别为0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mmol/L，其中对照添加含0.1% Tween-80的等量无菌水。将预培养48 h的病菌菌丝块（直径0.5 cm）移至含不同浓度MeJA的PDA平板中央，于25 ℃下培养，每个处理重复3次。48 h后用十字交叉法测定每个处理的菌落直径，以3个重复的算术平均值为菌落直径的测定结果，抑制率计算公式：抑制率（%）=［1-(处理菌落直径-菌块直径)/(对照菌落直径-菌块直径)］×100%［17］。

1.2.2 MeJA对水稻幼苗抗纹枯病的诱导效应 参照Park等［18］的方法，将纹枯病菌转接至PDA培养基正中央，置于25 ℃下培养48 h后，无菌条件下在菌落边缘打孔，获取直径5 cm的菌块备用。将浓度为0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mmol/L MeJA喷雾至4叶1心期的水稻幼苗上，使植株的全部叶片湿润滴液为止，对照（CK）为含0.1% Tween-80的无菌蒸馏水。处理12 h后，用无菌镊子夹取直径为5 cm菌块接种在水稻叶鞘内侧，每株接种一块，每个处理10株，重复3次，接种后立即用保鲜膜包裹，喷水保湿处理24 h。出现典型症状后，立即取下保鲜膜，保温保湿处理7 d左右进行病情指数调查［19］：病情指数=∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）×100；诱抗效果（%）=（对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指数×100%。

1.2.3 MeJA对水稻幼苗防御酶活性的影响 水稻长到4叶1心期时，设置4种方式处理：CK为对照；T-R：接种纹枯病菌丝块；T-MeJA：用0.10 mmol/L MeJA喷雾处理；T-MeJA+R：用0.10 mmol/L MeJA喷雾处理12 h后，转接纹枯病菌保湿处理。方法同1.2.2。每种处理方式3次重复。分别在处理0、24、48、72、96 h后，取水稻叶片2.00 g于液氮中冷冻保存，用于测定POD、CAT、SOD、PAL和PPO酶的酶活性。

POD、PAL、PPO酶活性测定参照Qin等［20］的方法，CAT、SOD酶活性测定参照陈利锋等［21］的方法。

1.3 数据分析

应用Excel 2019软件进行数据整理和图表绘制，应用SPSS 25.0软件中Duncan’s新复极差法进行处理之间的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 MeJA对水稻纹枯病菌菌丝生长的影响

由表1可知，将水稻纹枯病菌菌丝块置于在含不同浓度MeJA的PDA平板上，菌丝生长情况在数值上虽略有不同，但无明显差异，说明在0.01~2.00 mmol/L浓度范围内的MeJA对水稻纹枯病菌菌丝生长无直接抑制作用。

表1 不同浓度MeJA对水稻纹枯病菌菌丝生长的影响

2.2 MeJA对水稻幼苗抗纹枯病的诱导效应

使用0.01~2.00 mmol/L MeJA诱导处理均能降低水稻纹枯病病情指数，尤以0.10 mmol/L MeJA处理后的纹枯病病情指数最低，为22.96，此时诱抗效果为51.56%；0.05 mmol/L MeJA的诱抗效果次之，为43.75%，但2种浓度MeJA的诱抗效果差异不显著。此后，诱抗效果随着MeJA浓度的增加而下降，当浓度升高至2.00 mmol/L时，诱抗效果仅为7.81%，说明MeJA能诱导水稻对纹枯病产生抗性作用，且具有浓度效应（图1）。

图1 不同浓度MeJA对纹枯病的诱抗效果

2.3 MeJA对水稻防御酶活性的影响

2.3.1 过氧化物酶（POD）酶活性 如图2所示，CK的叶片POD酶活性随着处理时间的推移而逐渐升高，但24 h后叶片POD酶活性变化差异不显著；T-R、T-MeJA、T-MeJA+R这3种处理方式均能显著提高水稻叶片的POD酶活性；T-R处理在24 h达到峰值，比CK提高了8%，此后POD酶活性变化差异不显著；T-MeJA、T-MeJA+R对POD酶活性的影响要远高于T-R处理，这3种处理方式均在48 h达到峰值，分别比CK提高了42%、32%和7%，3种处理对POD酶活性的影响差异显著，此后其酶活性变化呈下降趋势，但72 h后的POD酶活性变化趋于平缓；在48 h时，不同处理对POD酶活性的影响差异显著，T-MeJA和T-MeJA+R处理对POD酶活性的影响显著高于T-R处理；在96 h时，各处理后的POD酶活性仍显著高于处理前，说明外界刺激诱导效应的可持续时间超过96 h。

图2 不同处理对水稻叶片POD酶活性的影响

2.3.2 多酚氧化酶（PPO）酶活性 由图3可知，与CK相比，T-MeJA、T-R和T-MeJA+R等3种处理均能显著提升叶片PPO酶活性，叶片PPO酶活性随着时间的推移而呈现明显的先升后降的变化趋势，CK的叶片PPO酶活性随着时间的推移而逐渐升高，但48 h后的叶片PPO酶活性变化无显著差异；T-MeJA+R处理的叶片PPO酶活性在24 h达到峰值，比CK增加了70%，此后随着时间的推移而缓慢下降；T-R和T-MeJA处理的叶片PPO酶活性在48 h达到峰值，分别比CK增加了54%和64%，72 h后的叶片PPO酶活性变化趋于平缓。从整体上看，T-R处理接种纹枯病对叶片PPO酶活性的诱导效应不低于T-MeJA喷雾处理。各处理后的叶片PPO酶活性与处理前的差异显著，说明外界刺激诱导效应的可持续时间超过96 h。

图3 不同处理对水稻叶片PPO酶活性的影响

2.3.3 苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性 由图4可知，CK的叶片PAL酶活性在48 h后达到峰值，此后酶活性变化差异不显著；T-R、T-MeJA、T-MeJA+R等3种处理方式均能显著提高水稻叶片PAL酶活性，叶片中PAL酶活性在48 h达到峰值后随着时间的推移而呈下降的趋势，T-R、T-MeJA、T-MeJA+R处理的叶片PAL酶活性峰值时分别比CK提高12%、27%和46%；48 h后T-R处理的叶片PAL酶活性变化差异不显著，而T-MeJA与T-MeJA+R处理48 h后的叶片PAL酶活性呈明显的下降趋势；T-R处理方式对叶片PAL酶活性的诱导效应明显低于T-MeJA、T-MeJA+R。各处理的叶片PLA酶活性在不同时段内保持相似的变化趋势，在24~72 h之间，不同处理对叶片PAL酶活性的影响存在显著差异，以T-MeJA+R的诱导效果最强，T-MeJA次之，T-R则最弱，外界刺激诱导效应的可持续时间超过96 h。

图4 不同处理对水稻叶片PAL酶活性的影响

2.3.4 过氧化氢酶（CAT）酶活性 由图5可知，CK的叶片CAT酶活性随着时间的变化而略有提高，但差异不显著；T-R、T-MeJA、T-MeJA+R等3种处理方式均能显著提高水稻叶片CAT酶活性，叶片中的CAT酶活性均呈先升后降的变化趋势，CAT酶活性在48 h达到峰值，T-R、T-MeJA、T-MeJA+R处理的叶片CAT酶活性分别比CK提高39%、61%和78%，3种处理方式对叶片CAT酶活性的影响差异显著；72 h时，T-MeJA+R处理的叶片CAT酶活性明显降低，T-R和T-MeJA处理的叶片CAT酶活性的下降趋势较为平缓。T-R处理后接种纹枯病对叶片CAT酶活性的诱导效应低于T-MeJA、T-MeJA+R处理。在96 h后，T-R、T-MeJA、T-MeJA+R各处理的叶片CAT酶活性分别比CK提高20%、40%和29%，3种处理方式对叶片CAT酶活性的影响也存在显著差异，外界刺激诱导效应的可持续时间超过96 h。

图5 不同处理对水稻叶片CAT酶活性的影响

2.3.5 超氧化物歧化酶（SOD）酶活性 由图6可知，CK叶片的SOD酶活性随时间波动变化，T-R、T-MeJA与T-MeJA+R这3种处理方式均能显著提高水稻叶片中SOD酶活性，叶片中SOD酶活性均呈先升后降的变化趋势，在48 h达到峰值，T-R、T-MeJA、T-MeJA+R这3种处理的叶片SOD酶活性分别比CK提高了34%、56%和69%，3种处理方式对叶片SOD酶活性的影响差异显著；T-R处理接种纹枯病对叶片SOD酶活性的诱导效应明显低于T-MeJA、T-MeJA+R，T-R、T-MeJA+R处理在72和96 h时的叶片SOD酶活性变化无显著差异，但仍高于CK，说明外界刺激诱导效应的可持续时间超过96 h。

图6 不同处理对水稻叶片SOD酶活性的影响

3 结论与讨论

JAs是植物抗病信号调控网络中的重要信号分子［22］，能激发植株体内处于蛰伏状态的防御系统，可诱导水稻对稻瘟病［14,23］、白叶枯病［15,24］、细菌性条斑病［25］的抗性。目前的研究表明：茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）和乙烯（ET）3种信号途径均参与调控水稻纹枯病的抗性［3,26-30］。本研究结果显示，0.01~2.00 mmol/L MeJA对水稻纹枯病菌的菌丝生长无直接的抑制作用，但0.10 mmol/L MeJA喷雾处理可显著降低水稻幼苗纹枯病病情指数，表明一定浓度的MeJA能诱导水稻对纹枯病产生抗性。

水稻幼苗接种纹枯病菌、用MeJA诱导处理后均能显著提高幼苗叶片中POD、PPO、PAL、CAT和SOD酶活性。吴样孙等［31］用3个对纹枯病抗性不同的品种接种水稻纹枯病，PAL、PPO、POD的酶活性水平均比未接种的对照高。钟庆燕［32］用JA处理的水稻植株PAL、POD和β-1,3-葡聚糖酶活性显著增加。向妙莲等［24］用MeJA处理水稻植株后的叶片POD、CAT、SOD和PPO酶活性均有不同程度的提高，这与本研究结果一致，表明施用外源MeJA与接种纹枯病菌均能引起水稻相关防御酶活性显著升高，以此增强水稻幼苗自身防御能力，从而提高水稻幼苗对纹枯病的抗性。钟庆燕［32］用JA处理对叶片PPO酶活性却无明显的诱导作用，这可能与所用水稻的品种抗性差异有关。对同一时间内不同处理之间的差异显著性分析可知，用MeJA诱导处理或诱导处理后再接种纹枯病菌，对POD、PAL、SOD、CAT酶活性诱导效应均显著高于单独接种纹枯病，但单独接种纹枯病对叶片PPO酶活性的影响效应要高于MeJA诱导或MeJA诱导后接种纹枯病；MeJA诱导再接种纹枯病对PAL、SOD、CAT酶活性的诱导效应明显高于MeJA诱导处理，而2种处理方式在叶片POD和PPO酶活性诱导效应方面的差异不显著。

本研究发现，MeJA对室内苗期水稻纹枯病最佳诱抗效果达51.56%，诱抗持续时间超过96 h，说明MeJA诱导水稻抗纹枯病应用于实际生产的前景较好，但用相同浓度MeJA处理大田环境下苗期的水稻纹枯病抗性诱导效果却不明显。MeJA诱导水稻自身产生的纹枯病抗性较弱，且田间环境复杂多变，众多因素可以影响其信号转导，或许是田间效应不明显的主要原因。为形成具有实际生产应用价值的水稻纹枯病绿色防控产品，还需在水稻－纹枯病互作机制及其抗性调控网络的基础上，对MeJA田间应用的条件及其效果开展进一步的研究。