根皮素前体脂质体制备及其体内药动学研究

禹 瑞，杨 璞，崔晓鸽，陈四清

（1.郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064； 2.河南中医药大学，河南 郑州 450046）

根皮素主要存在于草莓、梨、苹果等果蔬中，具有抗菌、抗氧化、降血糖、心血管保护等活性［1］，可有效抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡［2］，并且毒性极小［3］，具有开发成护肝、抗肝癌新药的潜力。但该成分溶解度为26.51 μg/mL［4］，油水分配系数（lgP） 为1.22［5］，在胃肠道中容易被破坏［6］，体内稳定性差，并且它也是多药耐药相关蛋白2 （MRP2）、P-gp 蛋白底物［6］，导致其口服生物利用度仅为8.676%［6］，目前已有胶束［7］、磷脂复合物［4-5］、纳米结构脂质载体［8］、醇质体［9］等相关报道。

前期报道，脂质体囊材主要由磷脂组成，生物相容性高，可增加药物溶解度、稳定性，并促进其吸收［10-11］； 磷脂具有保护肝功能、抗肝癌的协同作用［12］，可使肝癌高危患者受益，是一种药辅两用材料，但前者混悬液储存稳定性较差，而后者在处方中极易发生氧化［4］。前体脂质体可有效解决脂质体稳定性问题［13-14］，并且储存方便，故本实验制备根皮素前体脂质体，并考察其体内药动学，以期为该制剂后续开发提供依据。

1 材料

1.1 仪器 AUY220 型电子分析天平（日本岛津公司）； 安捷伦1100 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）； Zetasizer Nano Z 型激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）； CD-X15 型实验室超声仪（深圳市亦为实业有限公司）； HB10 型旋转蒸发仪（德国IKA 公司）； SH-2-001 型磁力搅拌器、HH-1型恒温水浴锅、HY-5 型恒温振荡器（常州市亿能实验仪器厂）； HM-D12 型氮气吹扫仪（山东恒美电子科技有限公司）； HS-100 型离心机（德国THF科学仪器公司）。

1.2 试剂与药物 根皮素对照品（批号110366-202009，纯度98.2%，中国食品药品检定研究院）； 根皮素原料药（批号191022，纯度97.0%，武汉福鑫化工有限公司）。胆固醇（批号20201012，亳州克拉玛尔生物科技有限公司）； 大豆磷脂（批号20210420，磷脂酰胆碱含量90%，上海艾韦特医药科技有限公司）； 甘露醇（批号190516，山西锦洋药用辅料有限公司）； 蔗糖（批号200118，湖南九典制药股份有限公司）。

1.3 动物 清洁级SD 大鼠，雌雄兼具，体质量180～200 g，由河南省动物实验中心提供，动物生产许可证号SCXK （豫） 2020-0001，实验室饲养至220～240 g 时进行实验。

2 方法与结果

2.1 根皮素含量测定

2.1.1 色谱条件 Phenomenex C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-水（35 ∶65）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长285 nm；进样量10 μL。

2.1.2 线性关系考察 称取根皮素对照品20 mg，置于100 mL 量瓶中，乙腈超声溶解定容，得200 μg/mL 贮备液，精密量取适量，流动相依次稀释至 5、2.5、1、0.1、0.25、0.05 μg/mL，在“2.1.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定。以对照品峰面积（Y） 对其质量浓度（X） 进行回归，得方程为Y＝13.152 5X＋0.896 0 （r＝0.999 6），在0.05～5 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液制备 取前体脂质体约0.1 g（根皮素含量约为1.15 mg），置于10 mL 量瓶中，加入pH 为6.8 的PBS 缓冲液8 mL，固定于振荡器（100 r/min） 上振荡至无不溶性颗粒产生，定容，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取0.5 mL 至50 mL 量瓶中，加流动相（功率250 W） 超声处理5 min，稀释定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 方法学考察 取0.05、1、5 μg/mL 对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得根皮素峰面积RSD 分别为0.40%、0.29%、0.46%，表明仪器精密度良好。取供试品溶液适量，于0、2、6、12、24、48 h 在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得根皮素含量RSD 为0.60%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。取同一份前体脂质体，按“2.1.3” 项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得根皮素含量RSD 为1.52%，表明该方法重复性良好。取前体脂质体粉末0.05 g，共9 份，分为低、中、高3 组，分别加入贮备液1.5、3、4.5 mL，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得根皮素平均加样回收率分别为100.79%、99.26%、101.24%，RSD 分别为0.63%、1.16%、0.57%。

2.2 前体脂质体制备 采用载体沉积法［14-15］，取根皮素原料药20 mg 及处方量大豆磷脂、胆固醇，置于圆底烧瓶中，加入20 mL 无水乙醇超声处理3 min 至溶解澄清，作为有机相。取处方量载体（乳糖） 过120 目筛，置于茄形瓶中，并固定于旋转蒸发仪上，将有机相通过导管分3 次加到载体中（以防止载体材料发生粘连），得混悬液，45 ℃减压旋蒸除去无水乙醇，即得。临用前取约0.1 g，加入pH 为6.8 的PBS 缓冲液10 mL 振荡15 min，过0.45 μm 微孔滤膜，作为混悬液。

2.3 包封率、粒径、Zeta 电位测定 取前体脂质体混悬液2 mL，置于超滤离心管中（截留分子量10 kDa），13 500 r/min 离心15 min，取超滤液，测定游离根皮素量（W1）； 另取2 mL，按“2.1.3”项下方法测定总根皮素量（W0），计算包封率，公式为包封率＝ ［（W0-W1）/W0］ ×100%。取前体脂质体混悬液0.1 mL，加入蒸馏水5 mL，摇匀后取适量至比色皿中，在粒度分析仪上测定其粒径、PDI； 另取适量至Zeta 电位专用器皿中，测定其Zeta 电位。

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2.4 处方优化 采用Box-Behnken 响应面法。

固定根皮素用量20 mg，前期预实验发现磷脂与胆固醇比例、脂（磷脂＋胆固醇） 药比、载（乳糖） 脂比对包封率影响较大，故分别作为自变量X1、X2、X3，因素水平见表1，再以包封率为因变量Y优化处方，平行3 次，结果见表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 试验设计与结果（n＝3）Tab.2 Design and results of tests （n＝3）

图1 各因素响应面图Fig.1picture_figure_titleResponse surface plots for various factors

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.5 验证试验 由图1 可知，最优处方为磷脂与胆固醇比例4.82 ∶1，脂药比16.48 ∶1，载脂比4.2 ∶1，包封率为83.88%，为了便于操作，将其修正为磷脂与胆固醇比例4.8 ∶1，脂药比16.5 ∶1，载脂比4.2 ∶1。按优化处方平行制备3 批样品，加入水相制成混悬液，按“2.3” 项下方法测定包封率，测得其数值为83.06%，与预测值83.88%接近（相对偏差为-0.98%）。再按“2.3”项下方法测得平均粒径为216.84 nm （图2），PDI为0.117，Zeta 电位为-22.76 mV （图3）。另外，前脂质体中根皮素含量为1.15%。

图2 根皮素前体脂质体粒径分布Fig.2 Particle size distribution of phloretin proliposomes

图3 根皮素前体脂质体Zeta 电位Fig.3 Zeta potential of phloretin proliposomes

2.6 形态观察 取前体脂质体混悬液适量，蒸馏水稀释50 倍，混匀后滴2 ～3 滴至铜网上，铺展，1.5%磷钨酸染色，晾干，在透射电镜 （13 000倍） 下观察其形态，结果见图4。由此可知，该制剂基本呈球形或椭圆形，并且粒径小于在激光粒度仪下观察时，这是因为在前者需先进行干燥，失水后其粒径会变小。

图4 根皮素前体脂质体透射电镜图Fig.4 Transmission electron microscopy image of phloretin proliposomes

2.7 体外释药研究 参考文献［8］ 报道，取前体脂质体粉末适量（根皮素含量均为8 mg），加入5 mL 模拟胃液制成混悬液，置于透析袋中（截留分子量8 ～12 kDa），扎紧； 另取8 mg，直接分散于溶出介质中。设定介质为1 000 mL 模拟胃液，温度为37 ℃，搅拌桨转速为75 r/min，于0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、18 h各取样5 mL，并及时补充5 mL 空白介质，0.45 μm 微孔滤膜过滤，测定累积释放度，同法考察在模拟肠液中的释药情况，结果见图5。由此可知，原料药在模拟胃液、模拟肠液中的累积释放度分别为15.17%、9.89%，而前体脂质体分别提高至90.24%、64.60%。

2.8 晶型分析 取根皮素、空白辅料（不含药物，辅料比例同前体脂质体）、物理混合物（药物与辅料比例同前体脂质体）、根皮素前体脂质体粉末适量，进行X 射线粉末衍射 （XRPD） 分析，设定扫描范围 （2θ） 为3° ～45°，扫描速度为4°/min，结果见图6。由此可知，原料药在6.9°、9.7°、14°、27.3°等处出现特征晶型峰； 物理混合物中仍可见根皮素晶型峰，表明简单混合未使原料药晶型发生变化； 前体脂质体图谱中仅见空白辅料晶型峰，原料药特征晶型峰均消失，表明它转变为无定形物质［16-17］。

2.9 稳定性研究 取前体脂质体及其混悬液适量，置于恒温恒湿箱中（温度25 ℃，相对湿度55%），于0、15、30、45、60、75、90 d 取样，测定包封率，结果见图7。由此可知，混悬液在60 d 时包封率降低至10%以下，而前体脂质体仍在80%以上，表明后者稳定性良好。

图7 不同时间点根皮素前体脂质体及其混悬液包封率（n＝3）Fig.7 Encapsulation efficiencies of phloretin proliposomes and their suspension at different time points （n＝3）

2.10 体内药动学研究

2.10.1 分组、给药与采血 取根皮素及其前体脂质体粉末适量，加入pH 为6.8 的PBS 缓冲液振荡15 min 制成药液 （根皮素质量浓度5 mg/mL）。12 只大鼠随机分为2 组，禁食过夜，按40 mg/kg剂量灌胃给药，其中根皮素采血点为0.25、0.5、1、1.5、1.75、2、3、4、5、6、8 h，其前体脂质体采血点为0.25、0.5、1、1.25、1.5、2、3、5、6、8、12 h，采血量均约为0.25 mL，置于肝素浸润离心管中，3 500 r/min 离心2 min。

2.10.2 血浆样品处理 参考文献［4，6］ 报道，将血浆样品置于37 ℃水浴中解冻，精密吸取0.1 mL至空白离心管中，加入1 mL 乙腈密封后涡旋5 min，4 ℃、10 000 r/min 离心5 min，取上清液至离心管中，45 ℃氮气吹干，0.1 mL 乙腈复溶，12 000 r/min 离心5 min，取10 μL 上清液。

2.10.3 线性关系考察 取根皮素对照品适量，空白血浆制成质量浓度分别为1 600、800、400、200、100、20 ng/mL 的血浆对照品溶液，按“2.10.2” 项下方法处理，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对其质量浓度（X） 进行回归，得方程为Y＝1.323 6X＋14.28（r＝0.996 5），在20 ～1 600 ng/mL 范围内线性关系良好。

2.10.4 方法学考察 取空白血浆、灌胃给药12 h后血浆样品、血浆对照品溶液（20 ng/mL） 适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图8，可知根皮素分离度理想，表明该方法专属性良好。取20、400、1 600 ng/mL 血浆对照品溶液适量，同一天内在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6次，测得根皮素峰面积RSD 分别为6.60%、7.18%、5.32%，表明该方法日内精密度良好； 同法每天测定1 次，连续6 d，测得根皮素峰面积RSD 分别为8.04%、5.43%、6.19%，表明该方法日间精密度良好。取同一份血浆样品，按“2.10.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得根皮素峰面积RSD 为3.68%，表明该方法重复性良好。取同一份血浆样品，在温度25 ℃、相对湿度55%下于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得根皮素峰面积RSD 为6.01%，表明样品在24 h 内稳定性良好。取20、500、1 500 ng/mL血浆对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得根皮素平均加样回收率分别为94.10%、92.53%、97.85%，RSD 分别为5.16%、7.61%、6.08%。

图8 根皮素HPLC 色谱图Fig.8 HPLC chromatograms of phloretin

2.10.5 结果分析 血药浓度-时间曲线见图9，再采用DAS 2.0 软件中的非房室模型计算主要药动学参数，结果见表4。由此可知，与原料药比较，前体脂质体tmax缩短（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相对生物利用度增加至2.44 倍，而t1/2无明显变化（P＞0.05）。

图9 根皮素血药浓度-时间曲线（n＝6）Fig.9 Plasma concentration-time curves for phloretin（n＝6）

表4 根皮素主要药动学参数（±s，n＝6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for phloretin （±s，n＝6）

表4 根皮素主要药动学参数（±s，n＝6）Tab.4 Main pharmacokinetic parameters for phloretin （±s，n＝6）

注： 与根皮素比较，**P＜0.01。

参数单位根皮素根皮素前体脂质体tmaxh1.78±0.281.18±0.22*t1/2h3.72±0.663.51±0.72 Cmaxng·mL-1503.49±152.771 190.61±355.94**AUC0～tng·mL-1·h1 303.26±174.783 186.11±550.34**AUC0～∞ng·mL-1·h1 384.50±188.393 292.74±578.81**

3 讨论

前期预实验发现，包封率随着胆固醇比例增加先升后降，可能是由于适量胆固醇可增加脂质体稳定性、包封率，但其用量过大时会引起膜超负荷［18］，导致包封率反而降低，最终选择磷脂与胆固醇比例3 ∶1 ～6 ∶1 进行优化。脂药比对脂质体包封率也有较大影响，脂质（胆固醇＋磷脂） 用量过小时不能有效包裹药物，导致包封率较低，而过大时会导致材料浪费，最终选择10 ∶1 ～20 ∶1 进行优化。载体用量过低时，前体脂质体重建困难［19］，而过高时其本身形成的冰晶会破坏脂质体，导致包封率降低［20］，最终选择2 ∶1 ～6 ∶1 进行优化。另外，磷脂本身具有保护肝功能、抗肝癌的协同作用［12］，可作为“药辅合一” 材料［21］。

本实验发现，根皮素前体脂质体在模拟胃液中的累积释放度高于模拟肠液中，可能是一方面前体脂质体在前者中的稳定性不佳［21］，原料药释放更容易，而另一方面原料药在碱性介质中不稳定［6］，影响了在模拟肠液中的累积释放度； 前体脂质体tmax显著缩短，可能与其释药速率较快有关［22］； 前体脂质体Cmax、相对生物利用度升高，可能是由于它可降低原料药粒径，从而促进后者溶出［15，20］；前体脂质体增加了原料药在胃肠液中的稳定性，提高了其进入血液循环的量。另外，无定形药物往往具有更高的吸收程度［7，11］； 药物粒径较小时可增加与胃肠道的接触面积，从而便于吸收［11，22］。但普通脂质体在胃肠道中的稳定性不高，并且外排蛋白（MRP2、P-gp） 的外排作用［6］最终影响了根皮素Cmax、相对生物利用度的提高程度。今后，将对脂质体表面进行修饰以增加其稳定性［23］，从而更有利于吸收。