人参皂苷Rh2对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及机制Δ

刘滢 ，谭辉 ，夏菁 ，熊伟 ，邓雪松 #（1.重庆三峡医药高等专科学校基础医学部，重庆 404120；2.重庆市抗肿瘤天然药物工程研究中心，重庆 404120；3.三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室，重庆 404120）

恶性胶质瘤多来源于低级别的星形细胞瘤细胞或正常的胶质细胞，其早期诊断和治疗方法虽不断发展，但患者易耐受，且复发率高、预后差、5年生存率低，现有手段的治疗效果仍然有限[1—2]。因此，深入研究恶性胶质瘤的发病特征并开发新的治疗方法，对改善胶质瘤患者的预后具有重要意义。

人参为传统中草药，是五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，至今已有两千多年的应用历史。现代药理学研究表明，从人参根茎中提取的主要活性成分人参皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）具有抗菌、抗肿瘤等药理作用[3—4]。本课题组前期研究初步证实，该成分对肿瘤细胞具有良好的体内外抑制活性[5]。有研究指出，人参皂苷Rh2能有效抑制大鼠C6胶质瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡[6]。可见，该成分有望成为胶质瘤临床辅助治疗的候选药物。

近年来的研究表明，组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylases，HDACs）的异常表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[7]。人类高发恶性肿瘤的最新相关研究表明，HDAC1/醇脱氢酶1A（alcohol dehydrogenase 1A，ADH1A）轴在抑制非小细胞肺癌细胞迁移并促进其凋亡过程中具有重要作用[8]，其可通过干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）来调控HDAC1的表达，进而上调肝癌细胞标志物p21的表达并抑制细胞增殖[9]；同时，有学者在另一项胶质瘤研究中指出，HDAC1活性的增强可能是肿瘤细胞生长及耐药的基础[10]。本课题组前期基于中国脑胶质瘤基因组图谱计划数据库（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA），利用在线分析工具（http：//www.cgga.org.cn）对数据库中胶质瘤患者的临床样本进行分析后发现，HDAC1 mRNA在恶性胶质瘤（WHO病理分级为Ⅲ、Ⅳ级）患者体内呈高表达，且其表达水平与肿瘤恶性程度成正比，与患者生存率成反比。可见，HDAC1有望成为恶性胶质瘤的潜在治疗靶点。本研究以人胶质瘤细胞为对象，拟分析人参皂苷Rh2对其增殖、凋亡的影响，并基于HDAC1初步探讨上述作用的可能机制，以期为进一步研究该成分的药理作用和开发恶性胶质瘤的治疗药物提供新的思路。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括ChemiDoc Touch型凝胶成像系统、M450型酶标仪（美国Bio-Rad公司），Cyto-FLEX型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），TGL-185型台式高速冷冻离心机（重庆平凡仪器仪表有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

人参皂苷Rh2原料药（货号78214-33-2，纯度≥98%）购自成都曼思特生物科技有限公司；胎牛血清和DMEM高糖培养基均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8试剂盒（批号K1018）购自美国APExBIO公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（批号WLA010a）购自沈阳万类生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号P0012）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒（批号P0012A）、细胞裂解液（批号P0013K）、青-链霉素双抗（批号C0222）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF；批号ST506）、小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（批号AF0003）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批号A0208）、HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（批号A0216）均购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠抗人HDAC1单克隆抗体（批号5356T）、兔抗人B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）单克隆抗体（批号3498T）、兔抗人Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）单克隆抗体（批号41162S）、兔抗人切割型胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）单克隆抗体（批号9664T）均购自美国CST公司；ECL化学发光显色试剂（批号P10100）购自苏州新赛美生物科技有限公司。

1.3 细胞

人胶质瘤U87、U251细胞由重庆医科大学干细胞与组织工程研究室提供。

2 方法

2.1 细胞培养及药液配制

U87、U251细胞用2倍以上体积的培养基混匀，以1 000 r/min离心5 min，弃去上清液；收集细胞，用含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的DMEM高糖培养基（以下简称“完全培养基”）重悬于培养瓶中，于5% CO2、37 ℃培养箱中培养。

取人参皂苷Rh2原料药20 mg，以二甲基亚砜（DMSO）200 μL充分溶解，配制成浓度为160 mmol/L的储备液，于-20 ℃下保存。临用前，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释成相应浓度的药液（DMSO不能超过总体积的0.1%）。

2.2 细胞增殖检测

采用CCK-8法进行检测。取对数生长期的U87、U251细胞，按5 000个/孔接种于96孔板中。将细胞分为空白组（只加完全培养基）、对照组（不加药物）和不同浓度人参皂苷Rh2组（10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L，浓度参考前期预实验结果设置），每组设5个复孔。分别于培养24、48、72 h时，加入CCK-8试剂10 μL，孵育2 h后，使用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光度（A）值，按下式计算药物作用48 h时的细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率＝（A对照组-A实验组）/（A对照组-A空白组）；同时拟合人参皂苷Rh2的半数抑制浓度（IC50）。

2.3 细胞凋亡检测

采用流式细胞术进行检测。取对数生长期的U87、U251细胞，按50 000个/孔接种于6孔板中。将细胞分为对照组（不加药物）和不同浓度人参皂苷Rh2组（30、50 μmol/L，浓度参考“2.2”项下结果设置，下同），每组设3个复孔。培养48 h后，收集各组细胞，按AnnexinⅤ-FITC/PI试剂盒说明书操作，使用流式细胞仪检测其总凋亡率。

2.4 HDAC1和凋亡相关蛋白表达检测

采用Western blot法进行检测。取对数生长期的U87、U251细胞，按50 000个/孔接种于6孔板中。将细胞分为对照组（不加药物）和不同浓度人参皂苷Rh2组（30、50 μmol/L），每组设3个复孔。培养48 h后，收集各组细胞并提取其总蛋白，以BCA法测定蛋白浓度后作变性处理。取变性蛋白适量，经SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维素膜上，用脱脂奶粉于室温下封闭0.5 h；加入HDAC1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、β-actin一抗（稀释比例均为1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；以TBST缓冲液洗膜3次，加入相应二抗（稀释比例均为1∶1 000），于室温下孵育1 h；以TBST缓冲液洗膜3次，加入ECL试剂显色并置于凝胶成像系统下成像，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的条带灰度值比值作为目的蛋白的表达水平。

2.5 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 人参皂苷Rh2对人胶质瘤细胞增殖的影响

经不同浓度人参皂苷Rh2作用24、48、72 h后，各药物组U87、U251细胞的增殖均受到明显抑制，其增殖抑制率均较对照组显著升高（P＜0.05或P＜0.01），且有一定的浓度依赖趋势。结果见图1（对照组细胞的增殖抑制率为0，未在图中展示）。人参皂苷Rh2对2种细胞作用48 h时的IC50分别为51.34、55.84 μmol/L，故后续将30、50 μmol/L作为该成分的干预浓度。

图1 人参皂苷Rh2对人胶质瘤U87、U251细胞增殖的影响

3.2 人参皂苷Rh2对人胶质瘤细胞凋亡的影响

经30、50 μmol/L的人参皂苷Rh2作用48 h后，U87、U251细胞的总凋亡率均较对照组显著升高（P＜0.01），且有随药物浓度增加而升高的趋势。结果见图2。

图2 人参皂苷Rh2对人胶质瘤U87、U251细胞凋亡的影响

3.3 人参皂苷Rh2对人胶质瘤细胞中HDAC1蛋白表达的影响

经30、50 μmol/L的人参皂苷Rh2作用48 h后，U87、U251细胞中HDAC1蛋白的表达水平均较对照组显著降低（P＜0.05或P＜0.01），且表达水平有随药物浓度增加而降低的趋势。结果见图3。

图3 人参皂苷Rh2对人胶质瘤细胞中HDAC1蛋白表达的影响

3.4 人参皂苷Rh2对人胶质瘤细胞凋亡相关蛋白表达的影响

经30、50 μmol/L的人参皂苷Rh2作用48 h后，U87、U251细胞中Bcl-2蛋白的表达水平均较对照组显著降低，Bax、cleaved caspase-3蛋白的表达水平均较对照组显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图4。

4 讨论

胶质瘤是人神经系统最常见且难治疗的恶性肿瘤，其复发率高，现有治疗方案效果有限，因此寻找安全、有效的治疗药物非常重要。中医药具有毒副作用小、药效持久、靶点多及作用较安全等特点，在提高患者生活质量、延长生存期方面具有显著优势，颇受临床关注[11]。挖掘具有胶质瘤临床治疗和患者预后改善潜力的中药及活性成分是目前的研究方向之一。考虑到人参皂苷Rh2对肿瘤细胞的体内外抑制活性以及对大鼠胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响，本研究选择了2种常用人胶质瘤细胞系——U87、U251细胞，初步评价了该成分的抗肿瘤活性。

有研究发现，人参皂苷Rh2能通过抑制HDAC1、HDAC2、HDAC6的表达而发挥抑制白血病细胞增殖的作用[12]，因此该成分可能是一种天然的HDAC抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACi）。已有研究表明，HDAC1在结肠癌、肝癌等多种肿瘤细胞中呈高表达，可参与组蛋白和非组蛋白的去乙酰化，并且与患者的不良预后存在密切关联[13—14]。本研究在前期研究的基础上，通过Western blot实验检测发现，人参皂苷Rh2可下调2种人胶质瘤细胞中HDAC1蛋白的表达，且这种作用有一定的浓度依赖趋势。可见，HDAC1有望成为肿瘤治疗的潜在靶点。

本研究采用CCK-8实验、流式细胞术实验检测了人参皂苷Rh2对人胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响，结果显示，人参皂苷Rh2能有效抑制2种人胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。为了进一步明确人参皂苷Rh2对胶质瘤细胞凋亡的影响机制，本研究针对经典的Bcl-2家族蛋白介导的细胞凋亡途径进行了探索。在Bcl-2家族蛋白中，Bax是促凋亡关键蛋白，可促进肿瘤细胞凋亡；Bcl-2是抑制凋亡的关键蛋白，可抑制肿瘤细胞凋亡。现有研究表明，促凋亡蛋白Bax可增加线粒体外膜的通透性，有利于细胞色素C等介质被释放到细胞质中，从而激活下游caspase-3，活化产物cleaved caspase-3可通过破坏细胞来促进细胞凋亡[15]；抑凋亡蛋白Bcl-2则可通过与Bax蛋白形成异二聚体而发挥凋亡抑制作用[16]。可见，细胞凋亡受Bax、Bcl-2蛋白的共同调控。Wang等[17]通过实验证实，下调HDAC1可影响Bcl-2/caspase信号通路的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡。本研究Western blot实验结果显示，人参皂苷Rh2能显著促进2种人胶质瘤细胞中Bax、cleaved caspase-3蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达。

综上所述，人参皂苷Rh2能抑制人胶质瘤U87、U251细胞增殖并促进其凋亡，其作用可能与下调HDAC1蛋白的表达和激活Bcl-2家族蛋白介导的凋亡途径有关。在后续研究中，本课题组拟构建HDAC1转染细胞株，进一步对人参皂苷Rh2的上述作用进行验证，以期为其分子机制的阐释提供参考。