猪脱细胞真皮基质对大鼠瘘管模型的修复作用及其对TGF-β1/NF-κB p65信号通路的影响

林琼琼，孟洪冰，金纯，周崇俊，宋张娟

1.温州医科大学附属第二医院 病理科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学 基础医学院，浙江 温州 325035；3.温州医科大学附属第二医院 肛肠外科，浙江 温州 325027；4.上海医药职工大学 培训部，上海 200092

肛门瘘管是临床常见的肛肠疾病之一，一项统计分析显示，肛瘘发病率为每1万人中有1.69例[1]。 起因主要为肛周脓肿破溃或切开引流术后未愈形成，以病程缠绵难愈为特点，伴有流脓、疼痛、瘙痒等症状。目前治疗方法以外科手术为主，包括括约肌保留手术、直肠黏膜瓣内口修补手术以及填充物封堵瘘管手术[2]。但在临床上经常遇到肛瘘术后创面愈合不良，其根本原因在于肛周脓肿破溃后窦道尚未形成期间，炎症尚未退散，盲目进行瘘管手术，导致窦道与脓腔均受到影响，致使创面难以愈合[3]。随着生物材料的发展，许多新的技术已经用来治疗难愈性肛门瘘管。

猪脱细胞真皮基质（porcine acellular dermal matrix, pADM）是一种韧性及强度较好的植入型生物组织材料，以猪皮为原料，经脱细胞与病毒灭活等工艺制备而成，为一种多孔性的三维网状结构，主要成分为胶原蛋白。由于pADM与人类脱细胞真皮基质相似，具有良好的生物相容性以及低免疫原性，因此它可以作为临床应用中人类ADM的替代品[4]。 2005年，马忠锋等[5]在动物实验中证明了pADM可以加速伤口修复。目前，pADM被广泛应用于临床组织修复，特别是在真皮组织置换和组织再生支架领域。这主要是由于pADM在促进成纤维细胞、胶原蛋白和血管再生方面的重要作用[6]。但是关于pADM在肛门瘘管中的作用机制尚不明确。

本研究通过构建大鼠瘘管模型，检测各组血清炎症因子含量以及创口组织TGF-β1/NF-κB p65信号通路相关蛋白的表达，观察pADM对瘘管模型创面的修复作用，以及对其作用机制的初步探讨。本研究发现，植入pADM可更好地减轻瘘管创口的炎症反应，促进血管和胶原纤维的生成。pADM作为一种生物相容性材料，在肛门瘘管的治疗中有广阔的应用前景。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级健康雄性SD大鼠40只，体质量220～250 g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（浙）2019-0001。适应性饲养1周后开始实验。

1.1.2 主要材料和试剂：pADM（专利号ZL 2016 1 0890806.1，深圳华臻生物科技有限公司）；瘘管栓（瑞栓宁，T型/SIS-T5，批号200701，西安瑞盛生物科技有限公司）。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）抗体购于美国Proteintech公司；转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、核转录因子-κB p65（nuclear factor-κB, NF-κB p65）抗体购于美国Abcam公司；白介素-6（interleukin-6, IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、VEGF、前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）等酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒购于深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备：40只SPF级SD大鼠随机分为假手术对照组、模型组、pADM组（真皮组）和瘘管栓阳性对照组（瘘管栓组），每组10只。参照王琛等[7]方法制作动物瘘管模型，假手术组使用0.9%氯化钠溶液，其余3组使用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合液。

1.2.2 给药方法：真皮组：取pADM支架材料（3 cm× 3 cm）填充瘘道，缝合创口；瘘管栓组：取瘘管栓 （3 cm×3 cm）填充瘘道，缝合创口，每日观察瘘道恢复情况并记录，直至材料被吸收；每组均治疗2周。

1.3 检测指标 ELISA法检测大鼠血清中IL-6、IL-1β、VEGF和PGE2含量，HE染色观察创面组织病理改 变，Western blot法检测创面组织TGF-β1、NF-κB p65和VEGF蛋白表达。

1.4 统计学处理方法 应用SPSS25.0软件进行统计处理。正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Bonferroni法，非正态分布计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用秩和检验；计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体质量和创面改变 治疗前，造模4周后，与假手术组大鼠相比，模型组、真皮组、瘘管栓组大鼠的体质量下降（P＜0.05），创面脓液色黄、质稠、量多。治疗2周后，真皮组、瘘管栓组大鼠体质量较模型组明显增加（P＜0.05），创面脓液明显减少。真皮组和瘘管栓组比较，大鼠的体质量变化差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1和图1。

图1 各组大鼠创面改变图像

表1 各组大鼠体质量变化情况比较（每组n=10，g）

2.2 大鼠创面组织病理改变 治疗2周后，HE染色发现，假手术组创面见较多毛细血管，少量炎症细胞浸润创面，并见少量纤维细胞和成纤维细胞。模型组创面均可见大量炎细胞浸润。真皮组、瘘管栓组与模型组比较，炎性浸润均明显减少，胶原纤维增多，其中真皮组胶原纤维较瘘管栓组更多更致密（见图2）。

图2 各组大鼠创面组织的HE染色结果（×200）

2.3 大鼠血清中IL-1β、IL-6、PGE2和VEGF含量比较 治疗2周后，与假手术组相比，模型组、真皮组及瘘管栓组IL-1β、IL-6和PGE2含量升高（P＜0.05），VEGF含量降低（P＜0.05）；与模型组比较，真皮组及瘘管栓组的IL-1β、IL-6和PGE2含量降低（P＜ 0.05），VEGF含量升高（P＜0.05）；瘘管栓组和真皮组间IL-1β、IL-6、PGE2和VEGF含量的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 治疗2周后各组大鼠IL-6、IL-1β、PGE2和VEGF含量的比较（每组n=10，pg/mL）

2.4 创面组织NF-κB p65、TGF-β1和VEGF蛋白的表达情况 治疗2周后，Western blot检测结果表明，与假手术组相比，模型组NF-κB p65蛋白表达升高，TGF-β1、VEGF蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，真皮组及瘘管栓组大鼠的NF-κB p65蛋白表达降低，TGF-β1和VEGF蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，真皮组和瘘管栓组NF-κB p65、TGF-β1和VEGF蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 治疗2周后各组大鼠创面组织NF-κB p65、TGF-β1和VEGF蛋白表达

3 讨论

肛门瘘管是肛管或直肠与肛门皮肤之间由于炎症性肠病或肛周脓肿等原因出现肛周肿痛、瘙痒、破溃流脓，经久不愈而形成的瘘道。手术是治疗肛门瘘管最常用最有效的方法，但如何在尽量保留肛门括约肌的前提下更好地提高术后创面愈合质量是临床关注的问题。炎症、胶原蛋白、新生血管及成纤维细胞共同营造的微环境是影响瘘管术后创面愈合的重要因素[8]。因此，提高术后创面愈合质量的关键在于减轻炎症反应，促进胶原蛋白和新生血管形成及成纤维细胞的增殖，改善伤口局部血液循环。pADM是一种广泛应用于组织修复的生物相容性材料，关于其在临床上的应用研究较多，但是具体的作用机制仍在探索中。

本研究发现，植入pADM或瘘管栓治疗后，大鼠体质量增加，创面脓液明显减少，血清中炎症因子IL-1β、IL-6和PGE2含量减少，表明pADM和瘘管栓均明显减轻瘘管创口的炎症反应。进一步地，HE染色发现，pADM促进胶原纤维新生的作用较瘘管栓更加明显。此外，研究表明，pADM具有低毒低致敏性以及更高的安全性和降解性，从而广泛应用于组织缺损的外科修复重建[9]。相较于其他生物材料而言，pADM中的基质胶原纤维组分和结构与人体的真皮组织更加接近；诱导的新生组织可以规律分布于其胶原纤维框架内从而改善创面瘢痕挛缩[10]。以上结果提示，pADM具有和瘘管栓相同的促进创口愈合的作用，但其成分组成和结构特征，使得pADM具有更广泛的临床应用前景。进一步研究结果表明，pADM促进创口修复的作用机制可能是由于激活TGF-β1/NF-κB p65信号转导途径，导致瘘管中TGF-β1和VEGF表达增加，NF-κB p65表达减少所致。

研究表明，pADM可以模拟天然组织的细胞外基质，刺激免疫系统激活巨噬细胞，释放一系列伤口愈合因子，如TGF-β1和VEGF等[11]。TGF-β1作为重要的成纤维细胞的强效趋化因子，通过动员成纤维细胞增殖，胶原合成及细胞外基质重塑，并诱导血小板-成纤维细胞结合，从而促进纤维化和瘢痕形成，加快伤口愈合速度[12-13]。此外，VEGF介导新生血管形成，在创伤愈合过程中有着重要的作用[14]。VEGF通过刺激内皮细胞的增殖、分化及迁移，能促进血管结构形成，慢性创伤修复中VEGF浓度与伤口愈合速度相关，VEGF上调有利于毛细血管新生和微循环系统重建，VEGF下调会导致血管生成减少从而延缓伤口愈合[15]。本研究结果显示，pADM组及瘘管栓组TGF-β1、VEGF表达均升高，说明两种材料都能促进新生血管的增生，刺激肉芽组织形成，从而达到加速创口愈合的作用。

既往研究发现，TGF-β1可刺激NF-κB p65从细胞质转位到细胞核，参与组织修复[16-17]。NF-κB在细胞质中以失活的NF-κB/IκBα复合物存在，当IκBα发生磷酸化时，会释放NF-κB转运到细胞核中引起转录，NF-κB信号通路广泛参与各种炎症反应[18]，NF-κB表达降低是炎症缓解的标志[19]，另一项研究也显示，p50同型二聚体和p50/p65异质二聚体在脓毒性休克中有明显的抗炎作用[20]。本研究发现pADM及瘘管栓均可导致NF-κB p65蛋白表达降低，提示两种材料可能通过TGF-β1/NF-κB p65信号通路，减轻炎症反应，为伤口的愈合提供良好的组织再生微环境。其具体机制尚有待进一步研究。

本研究具有一定的局限性，尽管我们的研究发现，真皮组血清中VEGF含量和创面组织中VEGF蛋白比模型组有明显升高，但是关于pADM促进血管新生还有待于深入观察和进一步验证。

综上所述，本研究证明了pADM抑制大鼠瘘管创口组织炎症反应，促进胶原蛋白新生及创口愈合，进一步的结果表明其中的作用机制可能是通过TGF-β1/NF-κB p65信号通路进行调控。作为一种具有良好性能的生物材料，pADM在肛门瘘管的治疗中发挥着巨大的临床应用潜力。