固氮微生物修复石油污染土壤研究进展

杜显元，张晗昱,，李丹丹*，李兴春，樊金娟，陈宏坤，王清威，艾绍磊,3，魏 炜,4，王 磊

1.中国石油集团安全环保技术研究院有限公司，石油石化污染物控制与处理国家重点实验室，北京 102206

2.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866

3.中国石油集团渤海石油装备制造有限公司，天津 300450

4.中国石油集团渤海装备辽河钻采有限公司，辽宁 盘锦 124000

5.中国农业大学生物学院微生物学与免疫学系，农业生物技术国家重点实验室，北京 100193

石油作为工业中使用量巨大的一种原料，在其勘探、开采、生产、运输、储存和提炼的过程中不可避免地由于意外泄漏导致周围环境污染，会对陆地和海洋环境产生严重破坏[1-2].土壤作为陆地系统的承载中心，对整个陆地生态系统功能的维持起着至关重要的作用.当石油污染物进入土壤后，土壤理化性质将发生改变，导致土壤质量和土壤功能下降[2-3].

目前，石油污染土壤微生物修复是一种低成本且无二次污染的有效技术手段[4].然而，由于微生物生长繁殖过程中遗传物质的合成需要大量氮元素，导致氮素成为限制微生物修复效率的关键因素之一[4].研究表明，添加氮肥有助于石油烃类降解菌的生长，提高降解菌群的活性，从而提升微生物的降解效率[3-4].实际上，过量的氮肥添加不仅会增加修复成本，还会促进硝酸盐的产生，引起环境的二次污染.

固氮微生物是一类在自然界中分布广泛的微生物，可以将大气中的氮气(N2)转化成生物可利用的氨(NH4+)[5-7].据统计，陆地生态系统通过微生物固氮途径的氮输入量为40～200 Tg/a[6-7].由此可见，固氮微生物是养分限制环境中氮素来源的重要供给者.目前，在石油污染土壤中发现了大量的固氮微生物，且这些土著固氮菌可以有效解决石油污染土壤修复中氮元素限制的问题，有利于污染土壤的微生物修复[8-11].尽管，国内外学者对固氮微生物在土壤石油污染物生物降解方面的作用已经开展了较多研究，但相关进展还鲜见综述报道.

鉴于此，本文基于国内外研究现状，梳理了石油污染土壤中主要的固氮微生物种类，介绍了固氮微生物在石油污染土壤修复中的应用现状以及影响固氮微生物活性的关键因素，并对目前的研究进展进行了总结和展望，以期为提高土壤石油污染物生物修复效率提供参考，这对改善我国石油石化行业土壤环境质量、保障区域土壤生态安全具有重要实际意义.

1 石油污染土壤固氮微生物的主要种类

1.1 土壤固氮微生物的主要类型

目前，已知的固氮微生物在属水平上不少于50个属.根据这些微生物与植物之间的关系，可将固氮微生物分为自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌(见表1)[12-16].自生固氮菌是一类不依赖于植物能够独立进行固氮的微生物，普遍存在于不同的土壤环境及植物根际中[12-13].共生固氮菌需要与植物共生才能有效固氮，分为结瘤类(与豆科植物共生)和非结瘤类(与真菌共生)[14].联合固氮菌能够独立进行固氮，但寄生于特定植物根际时会显著提升其固氮能力.联合固氮菌通常生长于植物根表，与植物相互作用，但不与植物形成共生结构[15-16].根据代谢类型的差异，固氮微生物可分为光合自养型、化能自养型和异养型[13].光合自养型固氮菌以鱼腥藻属(Anabaena)和绿硫菌属(Clathrochloris)等为代表，是一类以二氧化碳为碳源，利用光能进行固氮的微生物.化能自养型固氮菌以氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)等为代表，是一类不依靠任何有机化合物就能生长的固氮微生物.异养型固氮菌以固氮菌属(Azotobacter)、拜耶林克氏菌属(Beijerinckia)、固氮单胞菌属(Azomonas)等为代表，是一类以有机物作为碳源进行固氮的微生物[13].根据固氮微生物对氧的需求可以分为需氧型、兼性厌氧型和厌氧型固氮菌.

表1 常见的自生、联合和共生固氮微生物Table 1 The most frequently studied free-living,associative and symbiotic nitrogen-fixing microorganisms

1.2 石油污染土壤固氮微生物分布

不同油污环境中主要的固氮微生物类群汇总见表2.在属水平上，从石油污染环境中已鉴定出的固氮微生物接近30 个属.其中，分布最为广泛的类群主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、水生螺菌属(Aquaspirillum)和迪茨氏菌属(Dietzia)[17-22].不同地理区域在气候、植被和土壤性质等方面存在显著差异，从而形成了适应特定环境的固氮微生物群落.在南极石油污染土壤中，假单胞菌属(Pseudomonas)和水生螺菌属(Hydrospirillum)成为优势固氮菌[20].在佛罗里达州沙滩被石油污染后形成的沉积物中，根瘤菌属(Rhizobium)、弗兰克氏菌属(Frankia)、红细菌属(Rhodobacter)和红螺旋菌属(Rhodospirillum)[22]是主要的固氮微生物类群.芽孢杆属(Bacillus)和迪茨氏菌属(Dietzia)成为阿拉伯湾沿岸石油污染环境中主要的固氮菌[11].此外，即便在同一区域，由于微环境的差异也会导致同一地区不同生境下固氮微生物群落的分化.例如，在埃及尼罗河石油污染的水样中检测到凯氏小球藻(Chlorella kessleri)，而在附近的稻田土壤中可检测到稻田鱼腥藻(Anabaena oryzae)[23].总之，固氮微生物在油污环境中普遍存在，这表明强化油污环境中土著固氮微生物活性将会弥补环境氮限制，有可能会降低油污土壤生物修复对外源氮的需求.

表2 石油污染环境中常见的固氮微生物Table 2 The most frequently studied nitrogen-fixing microorganisms in petroleum-contaminated sites

1.3 石油污染土壤固氮微生物群落组成特征

由固氮基因nif所编码的固氮酶是微生物固氮过程发生的引擎.目前，已发现与固氮酶表达有关的基因多达14 个，包括nifB、nifD、nifE、nifHDK、nifH、nifJ、nifK、nifQ、nifN、nifS、nifU、nifV、nifW、nifZ[13].其中，nifH基因因其编码固氮酶的蛋白亚基更为保守，且具有分布广泛等特点，常被用于研究固氮微生物的分子标记物[24].当石油污染物进入环境中，微生物往往会增加群落的功能多样性以应对外界环境变化，这将会刺激新群落的形成.因此，研究人员常常会观测到nifH基因多样性在新污染的土壤环境中显著增加[25].然而，石油污染环境中通常含有较丰富的直链烷烃、环烷烃和芳烃等组分，当这些有毒有害组分超过微生物所能承受的范围时，固氮微生物多样性就会锐减[25].此外，石油污染环境中石油烃化合物的存在也会诱发具有较强石油耐受能力的固氮微生物群落形成，并逐渐演化成优势菌群，这将会降低石油污染土壤中固氮生物nifH基因的多样性[25].相反，特定类群的固氮微生物丰度会随着污染时间的延长而增加.例如：Dias等[26]通过PCR-DGGE 图谱方法证明了石油污染的红树林生态系统中α 变形菌门(Alphaproteobacteria)、β 变形菌门 (Betaproteobacteria)、γ 变形菌门(Gammaproteobacteria)、厚壁菌门(Phylum firmicutes)的相对丰度在污染土壤中显著增加[26].Gaby 等[27]利用高通量测序的方法在墨西哥湾也发现了固氮微生物群落组成在石油污染区域与未被污染区域之间存在显著性差异.通过污染场地的原位调查研究发现，根瘤菌目(Rhizobiales)和弗兰克氏菌目(Frankiales)在nifH固氮微生物中相对丰度最高，分别占总nifH基因序列的44%和21%[22].环境中显著增加的优势固氮菌也会提高nifH基因丰度.在石油污染后形成的沉积物中发现，nifH基因丰度在污染1 年后显著增加1～3 个数量级，且有助于石油烃的降解，这主要是因为较丰富的固氮微生物提高了固氮酶的活性[20,25].随着石油污染物浓度的逐渐降低，土壤环境中优势固氮菌的相对丰度也在逐渐降低[25].因此，合理利用这些在污染环境中与固氮功能密切相关的优势菌对实现高效生物修复污染场地具有重要意义.

2 固氮菌在石油污染土壤中的筛选与应用

在石油污染环境中，有机污染物的存在通常会导致土壤C/N 增加，限制了土著微生物的生长和修复过程.因此，在生物修复技术中，刺激土著微生物群落功能活性成为修复石油污染土壤的一种有效方法.固氮微生物在土壤中广泛存在，可为其他生物提供可利用的氮源，对石油污染土壤功能的恢复具有重要影响.固氮微生物显著提升了污染场地中石油烃类化合物的降解效率.这种促进作用一方面是由于土著固氮微生物固氮能力的增加促进了降解微生物的代谢过程，刺激了污染物的生物转化过程；另一方面，固氮微生物在固氮过程中除了将转化成的NH4+供给其他生物利用外，还可以合成自身所需的有机氮化合物.当固氮微生物死亡后还会通过释放含氮生物量残体间接贡献土壤氮元素，也是石油烃降解微生物获取氮元素的一种有效途径[20].因此，筛选适应于石油污染场地的高活性固氮菌将有利于微生物修复过程中克服氮养分限制问题.

2.1 石油污染土壤可分离的固氮微生物

依据固氮菌可以利用空气中氮气的原理，采用无氮培养基从石油污染土壤中将固氮菌从混合菌群中分离出来.目前，对所分离的固氮菌固氮能力的评估方法主要包括乙炔还原法、凯氏定氮法和15N 示踪法.3 种评估方法的原理、优点和不足之处汇总见表3[28-31].其中，乙炔还原法和凯氏定氮法因方法简便、成本低成为固氮菌株固氮能力评估的常用方法.

表3 固氮菌固氮能力测定方法Table 3 Determination method for the nitrogen-fixing ability of nitrogen-fixing bacteria

据不完全统计，近10 年来已从石油污染土壤中分离出的固氮菌近20 个属[28,32-34].其中，Chen 等[28]从辽宁盘锦油田污染土壤中分离获得的Sphingomonas oleivoranssp.nov.以及Chen 等[32]在台湾高雄炼油厂污染土壤中分离获得的Azoarcus oleariussp.nov.为2 株新种固氮菌，利用乙炔还原法证实了Sphingomonas oleivoranssp.nov.在培养2～10 d 内可将10%～50%的空气被乙炔取代，意味着该菌株具有较强的固氮酶活性.由于微生物固氮作用是一个高耗能的过程，这一过程需要消耗大量的碳源.因此，在固氮微生物分离过程中，研究人员也会通过改变培养基碳源类型从而分离获得可利用特定碳源的固氮菌.目前，从石油污染土壤分离固氮菌的培养基中常用到的碳源有葡萄糖、石油烃碳氢化合物、苹果酸三大类.不同污染环境中利用不同碳源所分离获得固氮菌汇总见表4.Keum 等[33]在美国夏威夷州多环芳烃的污染场地分离出以菲作为唯一碳源的中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的固氮菌.Onwurah[21]利用轻质原油作为唯一碳源从无氮培养基中分离出既可以降解石油污染物又可以进行固氮作用的两株菌，分别隶属于假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)，两株菌混合培养后最高的固氮量(以NH4+计)为8 μmol/mg.Radwan 等[11]采用3%(V/V)的重质原油作为碳源从阿拉伯湾分离出13 株可利用C9～C40的烷烃和芳香烃的固氮菌，通过乙炔还原法证实了所分离的菌株具有固氮酶活性，可在完全无氮的培养基中降解原油.Poonthrigpun 等[34]采用6%(V/V)的多环芳烃苊烯作为碳源从泰国石油污染土壤分离得到一株兼具石油烃降解和固氮能力的菌株，该固氮菌在3 d 内降解石油烃的量为600 mg/L.兼具固氮和石油降解功能的微生物具有较强的环境适应能力，这类微生物对石油污染物的强耐受性主要归咎于其细胞外除细胞壁和细胞膜保护作用以外，还含有丰富的多糖、脂多糖等、糖蛋白等物质，这些胞外组分可以降低石油污染物对细胞的毒害作用，提高菌株的抗逆能力[35].这些已发现的固氮菌是未来石油污染场地生物修复领域中提升环境氮素水平、实现高效修复污染土壤的重要菌种资源.

表4 石油污染环境中分离的主要固氮菌Table 4 Nitrogen-fixing bacteria isolated from petroleum-contaminated sites

石油污染环境中常伴随着高盐现象.高浓度盐离子严重制约着固氮微生物的生长、繁殖及功能活性.因此，传统的非耐盐固氮菌并不适合用于高盐环境下的生物修复.然而，高盐和石油污染物的双重胁迫会诱导嗜盐微生物的富集，有益于耐盐型固氮菌株的分离.翟栓丽[19]在胜利油田油泥污染土壤中分离出一株具有较强耐盐能力的固氮菌，该菌株在NaCl 浓度为4%时仍具有较强固氮酶活性.Al-Mailem 等[18]从科威特南部和北部海岸的高盐环境中分离出两株能在1～3.5 mol/L NaCl 条件下正常生长的固氮菌.耐盐型固氮菌的筛选对石油污染盐渍化土壤进行生物修具有重要作用.

2.2 固氮微生物与石油烃降解菌协同修复

氮素是石油污染环境生物修复过程中限制性的无机营养物质之一.通过原位添加适应环境的固氮菌，可加速原油污染土壤的生物降解过程，实现对原油污染土壤的原位修复.在这一过程中，固氮菌不仅为土著原油降解菌能提供活性氮素，还具有一定的协同代谢功能(见图1).利用固氮菌与石油烃类化合物降解菌之间的协同代谢关系，更有利于污染物的降解[8].

图1 石油烃降解菌与固氮菌协同代谢修复石油污染土壤Fig.1 Synergism between the petroleum-degrading microbes and nitrogen-fixing bacteria for the remediation of petroleum-contaminated soil

目前，从石油污染土壤中分离出的固氮菌成为原位生物修复的重要菌株资源.夏铭谦[36]将土著根瘤菌接种到美国加州北部石油污染的土壤中，石油污染物的去除率可达53%.Chaudhary 等[8]将石油烃降解菌与固氮菌共同接种到柴油污染土壤中，污染物的降解率可达到83%，与石油烃降解菌和无机氮(NH4NO3)组合处理下的柴油降解量(85%)相近.通过全氮含量分析进一步揭示了固氮微生物处理石油污染土壤的氮含量显著高于添加外源无机氮的土壤[8]，这意味着在石油污染土壤的生物修复中利用固氮菌将会降低对外源氮的需求[20].此外，通过固氮菌和石油烃降解菌的复配也有利于维持微生物菌群的稳定性.连续培养实验监测结果显示，石油烃降解菌和固氮菌复配后菌群数量持续增加，直至10 d 以后活体微生物总量保持相对稳定，在培养40 d 后仍具有较强的石油烃降解能力.Hamouda 等[23]也发现稻田鱼腥藻(Anabaena oryzae)和凯氏小球藻(Chlorella kessleri)联合体对脂族和芳香族化合物的降解效果优于单一菌群.当蓝藻-微藻联合体与1%原油混合培养30 d 后，芳香烃化合物可以完全被降解.翟栓丽[19]将我国胜利油田分离出的固氮菌与石油烃降解菌进行复配，所形成的生态修复菌剂对石油烃的降解率较对照组高出25%.Al-Mailem 等[37]通过微生物群落组成分析发现科威特沙漠土壤、黎巴嫩花园土壤、埃及花园土壤、德国向日葵土壤中均存在较高丰度的固氮微生物；将这4 种土壤配置成含油量为3%的油污土壤，分析原油的降解率，结果表明科威特沙漠土壤在污染6 个月后的原油降解率在82%以上，证实了较高数量的固氮微生物类群有利于石油污染物的降解.Zhou 等[38]也指出油污土壤中多环芳烃的降解率与土壤中固氮微生物数量以及固氮酶活性均呈正相关.还有研究利用兼具石油烃降解和固氮双重功能的菌株进行污染土壤修复，例如，Radwan 等[11]在阿拉伯湾沿岸分离出的迪茨氏菌属(Dietzia)和红球菌属(Rhodococcus)的固氮菌在无氮选择性培养基中对石油化合物的降解率分别为42.8%和54.8%.Dashti 等[39]在玉米和甘蔗中发现了石油耐受型的固氮微生物类群，将这类微生物接种到含1.0%轻质原油的无氮培养基中，原油含量在8 个月后减少了32%～38%；同时在培养基的总基因组DNA 中发现了较高丰度负责编码固氮酶的nifH基因.

上述结果表明，充分利用土著固氮菌有助于提高石油污染土壤的生物修复效率，且复配的菌群在提升环境氮含量的同时也往往具有协同作用.固氮菌和石油烃降解菌间代谢物的相互交换是固氮微生物促进石油污染土壤碳氢化合物去除的一个重要因素(见图1).一般来说，混合菌群往往会促进微生物间的协同作用，可扩展微生物的生态位，提高微生物在石油污染土壤中的集体生存能力，使其在寡营养环境中稳定生存[21].此外，固氮菌和石油烃降解菌还会利用信号分子作为诱导剂实现其对群落内生理活性的调控.从根际分离的一些革兰氏阴性细菌能够分泌一种可用于监测种群密度的N-酰基高丝氨酸内酯信号分子，在体外可以激活N-酰基高丝氨酸内酯特异性菌株[40].事实上，固氮菌和石油烃降解菌所分泌的信号分子(如葡萄糖、氨基酸、小分子有机酸等化合物)是介导二者相互作用、促进二者相互联系的一种重要方式.因此，与使用单一菌株相比，利用微生物协同作用构建的混合菌群修复石油污染土壤更具有优势，对提高污染场地生物修复效率具有重要意义.然而，在使用混合菌群实施生物修复之前，固氮菌群和石油烃降解菌群的相容性和协同效应必须一致.在未来，随着分子生物学的迅猛发展，基于高通量测序技术、宏基因组技术以及荧光蛋白标记和稳定同位素核酸探针标记技术，结合微生物共线性网络分析模型等先进技术手段，固氮菌的定殖能力和互作机制相关内容的研究也会随之更深入，这将有助于构建互作性更强的固氮-污染物降解混合菌群，对进一步提升其对石油烃污染环境的生物修复能力具有重要作用.

2.3 固氮微生物与植物联合修复

在石油污染土壤的生态修复中，微生物通常起主导作用.然而，微生物对环境因素变化极为敏感，往往导致修复效果不稳定.此外，不同地区石油污染土壤的污染程度不同，单纯依赖微生物修复存在见效慢的问题.植物根际处是石油烃碳氢化合物降解的热点区，但是根系的作用效率通常较微生物的作用效率低[41].利用植物-微生物联合修复手段既可以弥补二者的不足，还可同时兼具二者单独修复的优点.此外，有些固氮菌还可以产生细胞分裂素、生长素、类赤霉素等植物激素，这些生长激素能刺激植物的根毛和次生根的形成，有利于植物对矿物质的吸收与转运，提高植物根的抗逆能力[42].在植物-微生物联合修复过程中，植物根系的分泌物也会刺激固氮微生物的活性，从而有助于土壤中石油烃的微生物降解.

根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性菌，可与豆科植物结瘤共生固氮，具有较强的固氮能力，能与植物进行糖类和氨交换，是开展微生物与植物联合修复最理想的材料[43].通过盆栽实验发现，种植豆科植物苜蓿并接种根瘤菌剂的土壤与仅种植苜蓿或仅接种根瘤菌的土壤相比，多环芳烃的降解率提高了37%～51%[44].该研究证实，苜蓿与根瘤菌的共生关系可以刺激根际微生物群落的变化，有利于土壤中多环芳烃降解菌数量和微生物活性的提高，从而提升多环芳烃的降解效果.此外，在多环芳烃污染场地中也观察到了接种根瘤菌(Rhizobium)和巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)对豆科植物三叶草的结瘤和生长均有促进作用[45].邓振山等[46]也证实了利用豆科植物和根瘤菌的联合作用对污染物的降解效果优于微生物的单独作用效果.

与根瘤菌相比，尽管自生固氮菌固氮速率相对较低，但由于其固氮过程不依赖于豆科植物，且数量庞大、种类繁多，普遍存在于不同的土壤环境中，因此自生固氮菌应用范围更广.Suryatmana 等[47]利用苎麻通过接种固氮菌的研究案例发现，石油烃的降解率在13 周后可达89%，显著高于只种植苎麻植物的对照组.邓振山等[48]以我国陕北油田原油污染土壤为研究对象，开展了根际微生物和植物协同作用对原油污染土壤修复研究，结果表明，固氮菌对原油污染土壤具有修复作用，且固氮菌对植物根的生长有一定的促进作用.这项研究进一步揭示了固氮微生物和植物之间存在相互作用，有助于石油污染场地的生态修复.王京秀等[49]从北京房山区石油污染土壤中筛选出高效石油降解菌，通过种植3 种草(柳枝稷、荻草和狼尾草)开展植物和微生物联合修复实验，长达半年的监测结果显示植物和降解菌组合可以促进固氮菌的生长，表明种植适当的植物可以降低高浓度的污染物对固氮菌的抑制作用，显著提高石油污染土壤中固氮菌的含量，有助于污染场地的生态修复.这些研究证实了植物-微生物联合作用在石油污染土壤修复中有着重要作用[50].

尽管固氮菌对石油烃类化合物的微生物降解有促进作用，但不同植物与固氮菌也可能存在拮抗作用.例如，程国玲[51]在修复矿物油污染土壤案例中发现，接种固氮菌的白蜡和苜蓿对矿物油的降解率比仅种植植物的对照组仅提高了9%；然而通过外生菌根真菌、降解菌、固氮菌联合修复，矿物油的降解率则显著提高60%.因此，在应用固氮菌修复石油污染土壤时，还需要注意根据修复场地土壤环境适当调整菌种组合及复配条件，这也是实现微生物成功修复的基本条件.

3 石油污染土壤中固氮微生物活性的影响因素

提高固氮微生物在石油污染环境中的固氮效率，有利于维持环境中氮素水平，有助于土壤石油污染物的生物降解.然而，固氮微生物的活性往往会因环境条件的改变而发生变化.因此，了解影响固氮微生物活性的关键因素，对提高石油污染土壤中菌株的功能活性具有重要指导意义.

3.1 温度

温度的变化会改变固氮菌细胞膜的流动性，从而影响其细胞内与细胞外的物质和能量的交换.此外，温度也会对底物的溶解度产生一定影响，进而影响固氮菌对可利用性底物的获取能力[52].一般而言，适宜的温度有利于固氮微生物的生长和繁殖，且在一定温度范围内，随着温度的升高，固氮微生物的代谢活性也会增强，从而固氮效率也会提升[52-53].然而，当温度超过微生物最适温度时，其功能活性往往会受到抑制作用.Eckford 等[20]从南极石油污染土壤中筛选出的固氮菌在10～22 °C 下可以快速生长，当温度超过22 °C时则不利于该菌株的生长.相似的研究[20]中发现，一株假单胞菌属(Pseudomonas)的固氮菌酶活性在4 °C和10 °C 环境下比在22 °C 下更高.孙寓姣等[54]在天津大港油田污染土壤分离得到的根瘤菌在25 ℃下占据明显优势.对于豆科植物根瘤菌而言，最适宜结瘤和固氮的温度是20 ℃左右，温度过高或过低都会导致根瘤菌的活性降低[55].蔡苗等[56]在根际土壤中筛选出了3 株固氮菌，其中两株菌OD600吸光值在20 ℃时最高，另一株菌OD600吸光值在30 ℃时最高.Radwan等[11]在科威特地区分离出的Pseudoalteromonassp.在春季、秋季和冬季形成的菌落数量分别占总细菌群落的27%、57%和82%，说明季节性温度的差异会影响菌株的生长繁殖.固氮菌对温度的响应往往与其长期生存的环境有很大关系，因为温度会选择最适生理条件的微生物从而调节固氮微生物的群落组成[52].

3.2 氧气

固氮微生物对氧气通常是非常敏感的，主要是因为含铁蛋白和钼蛋白的固氮酶在有氧条件下很容易发生不可逆失活[57-58].已有研究[57]证实，固氮功能相关的nifA蛋白的表达也受氧气的调控.氧气浓度会调控根瘤菌(Rhizobium)和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的整个固氮过程.陈因等[59]研究指出，在0～30%氧浓度下，蓝藻的固氮酶活性由518 nmol/(h·mL)(以C2H4计)降至146 nmol/(h·mL)，说明蓝藻的固氮能力在氧气浓度过高时会受到抑制.氧气对固氮菌的影响会因环境条件的变化而产生不同的效果.当有光照时，束毛藻属(Trichodesmium)的固氮菌在无氧条件下固氮酶活性可达到最高；当无光照时，需要5%的氧气浓度才可使其活性达到最高[60].不同固氮菌对氧浓度的敏感程度存在差异主要是由于固氮微生物在长期进化过程中会形成了多种保护机制来适应有氧环境.

3.3 pH

环境酸碱度的变化会改变微生物细胞膜的电荷，对细胞膜的通透性产生一定影响，这将关系着微生物细胞内与细胞外物质和能量的交换能力，会抑制微生物对营养物质的吸收速率，影响到固氮酶活性的表达[61].此外，变化的酸碱环境也会改变微生物细胞内核酸和蛋白质等大分子物质的电荷，进而会影响到微生物的生理活性[62].因此，pH 的变化对于固氮微生物活性有较大影响.申磊等[63]从圆果雀稗(Paspalum orbiculare)中分离获得的5 株固氮菌中，其中3 株固氮菌的活性在pH 为7.0 时最高，另外两株固氮菌的活性在pH 为8.0 时最高.Wen 等[64]从石油污染环境中分离出根瘤菌属(Rhizobium)的固氮菌株在pH 为5.0～9.0 范围内均可生长，其最适生长pH 为7.0～8.0.固氮弓菌属(Azoarcus)在pH 为7.0～8.0 范围内均可生长，且最适pH 为7.0.综上，大部分固氮微生物生长繁殖及功能活性的维持最佳pH 为7.0～8.0[65].此外，不同菌株复配形成的复合菌剂适应的pH 也不同[32].刘青海等[66]对分离的解磷菌和根瘤菌进行复配的研究结果显示，根瘤菌在pH 为8.5 时生长最好，解磷菌在pH 为8.0 时生长最好，而复配菌剂在pH 为6.0～8.0 均可生长.因此，在配制微生物的复合菌剂时应根据菌株实际情况调节pH 使微生物的固氮活性达到最佳效果，这将有利于固氮微生物促进石油污降解微生物的修复效率.

4 结论与展望

a) 固氮微生物种类繁多，已知的固氮微生物在属水平上不少于50 个属.在石油污染土壤中分布较为广泛的类群主要包括假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、水生螺菌属(Aquaspirillum)和迪茨氏菌属(Dietzia)，这些固氮菌是实现高效修复污染土壤的重要菌种资源.尽管已从石油污染土壤中分离出大量的固氮菌，并证明这些固氮菌有助于污染环境中石油烃的降解，然而，基于纯培养方法获得的固氮菌株在菌群物种多样性中通常仅占很小的比例.因此，利用传统分离方法导致石油污染环境中大量固氮菌株资源无法被充分地挖掘.此外，石油污染土壤环境复杂，这也加剧了可培养的固氮菌的分离难度.在未来，可以利用单细胞拉曼耦合培养技术等先进技术方法挖掘环境中未培养的固氮菌株，将进一步丰富石油污染场地的菌种资源库.

b) 利用固氮菌与石油烃类化合物降解菌之间的协同代谢关系，可提高微生物在石油污染土壤中的集体生存能力，更有利于污染物的微生物降解.通常情况下，微生物混合菌群比单一菌株对原油的降解效果更好.此外，有些固氮菌还可以产生植物激素，有利于植物对矿物质的吸收与转运，提高植物根的抗逆能力.植物-微生物联合修复过程中，植物根系的分泌物也会刺激固氮微生物的活性，从而有助于土壤中石油烃的降解.因此，微生物混合菌群及微生物-植物联合修复是当前最受欢迎的修复方式.然而，固氮菌协同石油烃降解菌以及固氮微生物与植物联合修复促进石油污染物的微生物降解过程是一个复杂的生化过程.当前研究主要集中于石油污染土壤固氮菌的筛选与固氮菌性能的评价，对混合菌群以及与植物联合促进石油烃降解过程机制的研究较少.在未来可以从分子生物学及酶学等方面系统地研究石油污染环境中固氮菌、石油烃降解菌以及植物之间的相互作用机制，加强石油污染环境中微生物与植物联合修复机理的研究，为微生物-植物联合修复技术的建立以及工程实际应用提供有力支撑.

c) 固氮微生物促进石油污染环境中碳氢化合物的微生物降解过程不仅与固氮微生物自身代谢活性密切相关，还会受环境因素(如温度、氧气、pH 等)的综合影响.在未来实际现场修复过程中，微生物会同时受到多因素共同的影响.因此，要更多地结合拟修复场地的实际地理条件，加强多因素交互作用对固氮微生物群落的稳定性和功能活性的影响，深入探究具有固氮和石油烃降解功能的微生物对环境变化响应的分子调控机制，为营造有利于固氮微生物生存、繁殖和代谢的最适环境提供技术支撑，这也是实现石油污染土壤绿色高效修复的重要基础.