STON1基因与胃腺癌免疫浸润的相关性研究

何燕芳，马燕花，谢娇娇，梁建华

1.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；

2.平凉市中医医院，甘肃 平凉 744000

胃癌(gastric cancer，GC)是恶性肿瘤相关死亡的第三大原因，仍然是全球一个相当大的健康问题[1]。中国是胃癌的高发区。国家癌症中心发布的数据显示：2016 年我国胃癌新发及死亡病例数为39.7 万及28.9万，占全部恶性肿瘤的新发及死亡病例数的9.7%及12%，发病及死亡均居第3 位[2-3]。胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)约占所有GC病例的95%[4]，尽管近几十年来临床在STAD的诊断技术和治疗方法上取得了巨大进步，但STAD 患者的预后仍然很差。大多数胃癌患者在确诊时存在局部或远处转移，已无手术治愈的机会，只能通过姑息性化学治疗和/或靶向药物治疗延长生存期，但该类疗法的获益较为有限，患者的中位生存期仅约1年[5]。由幽门螺杆菌感染引起的慢性炎症与GC 相关[6]，GC 发生发展过程中的炎症反应已经引起了广泛关注[7-8]，肿瘤免疫微环境不仅被认为是炎症相关癌症模型，而且在肿瘤进展中发挥着至关重要的作用，特别是肿瘤相关巨噬细胞[9]，越来越多的证据表明，巨噬细胞浸润率高与STAD 的不良预后密切相关[10]。

随着高通量分子技术的不断发展，越来越多的免疫治疗检查点被发现，免疫治疗方式是胃癌的新兴研究方案。因此，基于预后生物标志物的探索，迫切需要一个预测患者的生存和个体化治疗的标志物[11]。Stonins是一个进化保守的家族，介导神经肌肉连接处小泡的恢复和循环，由Stonin1 (STON1)和Stonin2(STON2)[12]组成，人类STON1 蛋白由735 个氨基酸组成，预测分子质量为83 kDa[13]，此外，STON1基因甲基化水平被证实是肥胖症进展和个性化治疗发展的一个预后标志[14]，STON1 在调节神经胶质抗原2 (NG2)的内吞作用方面具有不可替代的作用，NG2 可能是胶质母细胞瘤和黑色素瘤的癌基因[15]，但STON1在癌症中介导特定分子机制的潜在功能仍然完全不清楚。

因此，本研究从UCSC XENA[16]下载TCGA 和GTEx 基因表达矩阵，对其预后价值进行评价，探讨STON1 与其免疫应答的关系，拟为STAD患者的个体化治疗和预后评估带来新切入点。

1 材料与方法

1.1 数据收集和整理 从UCSC XENA(https://xenabrowser.net/datapages/)经Toil 流程[17]统一处理的TCGA 和GTEx 的TPM 格式的RNAseq 数据，并从中提取TCGA 的STAD 和GTEx 中对应的正常组织及泛癌数据，最后将TPM(transcripts per million reads)格式的RNAseq数据进行log2转化以备后续进行分析。

1.2 差异表达基因(DEGs)分析 利用R(3.6.3版本)中R包ggplot2(3.3.3版本)进行STON1差异表达基因，绘制满足|log2(FC)|＞1&p.adj＜0.05 的DEGs 火山图；运用R包DESeq2[18](1.26.0版本)分析得出STON1高、低表达组的DEGs，为基因富集分析准备数据。

1.3 功能富集分析 包含基因本体(GO)[即生物过程(ΒP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)]和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析；通过org.Hs.eg.db 包(3.10.0 版本)用于ID 转换；clusterProfiler 包[19](3.14.3版本)用于富集分析，将DEGs 的阈值定义为|log2(FC)|＞1&p.adj＜0.05得到富集结果。

1.4 基因集富集分析 用一个预先定义的基因集MSigDΒ 数据库(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)中的基因来探索STON1 高、低表达组DEGs 的功能和表型，将每次分析计算次数设置为1 000次，满足FDR(qvalue)＜0.25且p.adjust＜0.05的数据集认为差异有统计学意义[20]。

1.5 免疫浸润和免疫检查点分析 纳入24种免疫细胞[21]通过GSVA包[22](1.34.0版本)对单样本基因集富集分析(ssGSEA)进行免疫浸润分析；进一步分析STON1与免疫检查点之间的相关性，包括CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1、LAG3、CD274)[23-25]。

1.6 预测模型开发 单因素和多因素的Cox 回归分析评估STON1能否作为一个独立的预后因素，主要的临床参数包括TNM 分期、年龄、主要治疗结果以及病理分期，同时绘制1 年、3 年、5 年预测OS 的列线图以及校准图，通过观察校准图，以对角线作为最佳预测值，判断模型对实际结果预测效果评估，使用一致性指数(C 指数)评估列线图的准确性；此过程主要通过rms包(6.2-0版本)和survival包(3.2-10版本)完成数据分析[26]。通过Kaplan-Meier plotter 数据库(https://kmplot.com/analysis/)识别生存生物标志物[27]的在线网站和基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库(http://gepia2.cancerpku.cn/#survival)[28]，分析STAD 患者中STON1表达的预后价值。

1.7 免疫组织化学验证 利用HPA 数据库(Human Protein Atlas) (https://www.proteinatlas.org/)对胃的正常组织与肿瘤组织之间的STON1 蛋白质表达水平进行免疫组织化学验证，比较正常组织和胃癌组织中STON1基因蛋白质的表达水平。

1.8 统计学方法 统计方法和图表都使用R 编程语言(版本3.6.3)进行。分类资料满足理论频数＞5且总样本量＞40的条件，选用χ2检验，不满足理论频数＞5或总样本量＞40的条件，选用Fisher精确检验；数值变量满足正态分布，选用t检验，不满足正态分布，选用曼-惠特尼U检验(Mann-WhitneyUtest)，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 STON1 在STAD 和泛癌中的表达 利用TIMER2.0 数据库确定STON1 在不同TCGA 肿瘤中的转录水平。共研究了61 种人类癌症类型，发现与正常组织相比，STON1 mRNA 在STAD 表达量降低(图1A)，在大多数癌症，包括肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)和肾嫌色细胞癌(KICH)等癌症中STON1 mRNA水平下降，而胆管癌(CHOL)、多形性胶质母细胞瘤(GΒM)和头颈部鳞状细胞癌(HNSN)STON1 mRNA水平上调(图1Β)。

图1 正常组织和STAD中STON1的表达Figure 1 STON1 expression in normal tissues and STAD

2.2 STON1 DEGs 分析 在STON1 的高、低表达组中共鉴定出2 519 个DEGs 满足|log2(FC)|＞1&p.adj＜0.05，高表达的基因数目2 152 个，低表达的基因数目367个(图2)。

2.3 STON1 功能富集分析 GO 和KEGG 富集分析的结果如下，在满足p.adjust＜0.1&qvalue＜0.2 条件下，ΒP共有1 096条，CC共有153条，MF共有125条，KEGG共有53 条，其中ΒP主要包括细胞外基质组织、细胞外结构组织和肌肉收缩等，CC 包括含胶原蛋白的细胞外基质、纤维部分收缩和收缩纤维等，MF包括细胞外基质结构成分、糖胺聚糖结合和肝素结合等；KEGG包括神经活性配体-受体相互作用、蛋白质的消化吸收和钙信号通路等(图3和表1)。

表1 GO及KEGG通路分析结果Table 1 Results of GO and KEGG pathway analysis

图3 GO和KEGG富集分析圈图Figure 3 Circle diagram of GO and KEGG enrichment analysis

2.4 STON1 基因集富集分析 使用预先定义的基因集MSigDΒ 数据库进行GSEA 分析，进一步鉴定STON1高低表达水平在STON1中所涉及的生物学功能，在满足FDR(qvalue)＜0.25且p.adjust＜0.05情况下，STON1高表达的DEGs显著富集于GO功能中的免疫应答调节信号通路、淋巴细胞活化的调节、T 细胞激活、体液免疫应答以及吞噬作用等(图4A)；低表达组显著富集于核糖体、线粒体基因表达、呼吸小体、氧化还原酶复合物和病毒基因表达等(图4Β)；癌症途径以及WNT、MAPK 信号通路等KEGG 通路在高表达STON1的DEGs中显著富集(图4C)；核糖体、氧化磷酰化、DNA复制、RNA降解和嘧啶代谢等KEGG通路在低表达STON1 的DEGs中显著富集(图4D)；在标志性基因集中上皮间质转换、炎症反映、细胞凋亡、KRAS信号传导和TGF-β信号传导显著富集于STON1 的高表达组中(图4E)；MYC、E2F 靶标、氧化磷酰化、G2M检查点以及DNA修复显著富集于STON1低表达组中(图4F)。这些结果提示STON1 在STAD 患者肿瘤微环境和免疫应答中的潜在作用。

图4 GSEA 的基因富集分析Figure 4 Gene enrichment analysis of GSEA

2.5 STON1 免疫浸润和免疫检查点分析 肿瘤免疫浸润在预测OS发生率中起重要作用。观察24个免疫细胞中STON1表达组之间的相互关系，发现T细胞和细胞毒性T细胞(cytotoxic cell)均P＜0.05，Β细胞、CD8+T细胞、浆细胞样DC(pDC)、嗜酸性粒细胞、未成熟树突状细胞(iDC)、巨噬细胞(macrophages)、肥大细胞(mast cell)、自然杀伤细胞(NK cell)、树突状细胞(DC)、中央型记忆T 细胞(Tcm)、效应记忆T 细胞(Tem)、滤泡辅助性T 细胞(TFH)、Tgd 以及Th1 均在STON1 中高表达(P＜0.001)；Th17 细胞和Th2 均在STON1 中低表达(P＜0.001)，而中性粒细胞(neutrophlis)、调节性T 细胞(Treg)、aDC、NK CD56bright 细胞、NK CD56dim 细胞和辅助性T 细胞(T helper)与STON1 无相关性(图5A)。进一步评估24 种免疫细胞与STON1 的相关性，结果表明STON1 与Th17 细胞(r=-0.113，P=0.029＜0.05)和Th2 细胞(r=-0.116，P=0.025＜0.05)呈负相关；中性粒细胞、Treg、aDC、NK CD56dimp细胞和T helper 细胞与STON1 无相关性，其余免疫细胞与STON1 呈正相关(图5Β、5C)。此外，分析了STON1 表达与免疫检查点之间的关联，其中CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R 的P＜0.001，CTLA-4 的P＜0.01，PDCD1 的P＜0.05，说明STON1高表达组的CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1 的表达水平均高于低STON1 表达组(图6A)，同时进行了8 个免疫检查点之间相关性检测，发现CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1 的P＜0.01、r＞0，LAG3、CD274 的P＞0.05，说明CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1与STON1 的表达呈正相关，而LAG3、CD274 与STON1 的表达无相关性(图6Β)。

图6 STON1表达与免疫检查点的关系Figure 6 Relationship between STON1 expression and immune checkpoints

2.6 STON1 的表达与临床特征的关联性 单因素Cox 回归分析发现TNM 分期、疗效、年龄、残余肿瘤、STON1 的表达水平以及病理分级与OS 相关(P＜0.05)，见表2；进一步行多因素Cox回归分析并绘制森林图，结果提示STON1 是一个独立的预后因素(HR=2.063，95%CI=1.306～3.260，P=0.002)，见图7。

表2 STAD中STON1表达与临床基线数据的关系Table 2 Relationship between STON1 expression in STAD and clinical baseline data

图7 多因素Cox回归的森林图Figure 7 Forest plot of multivariate Cox regression

2.7 构建预测模型 将STON1 及临床特征纳入列线图模型(图8A)，分别预测1 年、3年、5年的生存概率，同时绘制校准图(图8Β)，C 指数为0.711(95%CI=0.687～0.735)；为了进一步分析STON1的预后价值，使用GEPIA2 和Kaplan-Meier plotter 肿瘤学数据库进行生存分析，结果表明在STAD 中，STON1 的表达水平与OS密切相关，STON1 高表达的患者比STON1 低表达的患者预后更差(P＜0.05)，见图9A、9Β。

图8 STAD中STON1基因的预后预测模型及校准图Figure 8 Prognostic prediction model and calibration plot of STON1 gene in STAD

图9 总生存率的Kaplan-Meier曲线Figure 9 Kaplan-Meier curves for overall survival

2.8 免疫组织化学染色结果 胃中STON1 表达水平在肿瘤组织高于正常组织，在正常组织中未检测到(图10)，进一步说明STON1 的高表达是胃癌预后不良的因素。

图10 正常胃组织与胃癌组织中STON1的蛋白质表达水平Figure 10 Protein expression level of STON1 in normal gastric tissues and gastric cancer tissues

3 讨论

近年来，随着免疫治疗在肺癌、肾癌等多个实体瘤中取得了较好的治疗效果[29-30]，也给胃癌患者的治疗带来了新的希望[31-32]。基于ATTRACTION-02 研究，纳武利尤单抗(Nivolumab)已在日本、韩国等获批胃癌三线治疗适应证[33]，而CHECKMATE-649研究也将胃癌化疗联合免疫治疗正式进入一线治疗行列[34]，在全球范围内，胃癌的新辅助免疫治疗的临床试验(如KEYNOTE-585)正在进行[35]。基于肿瘤微环境目标的临床个体化治疗的快速进展给STAD 患者带来了希望[36]，因此，进一步识别新的免疫治疗药物和生物标志物来指导临床治疗和预测STAD患者的生存仍然具有挑战性。本研究发现STON1 在包括STAD 在内的大多数人类癌症类型中均降低，并且与STAD 的分级、分期和远处转移密切相关。此外，STON1 过表达预示着预后不良并与免疫应答相关。

根据富集分析的结果，本文探讨了ssGSEA 的免疫浸润水平，发现大多数免疫细胞与STON1 mRNA表达呈正相关，包括调节性T细胞(Treg)、1型T辅助细胞(Th1)、滤泡辅助性T 细胞(TFH)和Tgd。产生干扰素-γ的Th1 细胞分泌TNF，导致肿瘤破坏，Th1 和Th2细胞不仅可以招募肿瘤部位附近的NK细胞和巨噬细胞发挥抗肿瘤作用，还可以作为增强子促进肿瘤特异细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)反应[37]。这些免疫细胞高表达STON1 在STAD中高度浸润，在免疫细胞中，NK细胞与STON1表达的相关度最高(r=0.687，P＜0.001)，浸润程度与预后有关。NK细胞是细胞毒性淋巴细胞，通过激活或抑制表面受体来调节肿瘤活性，能强化免疫治疗的抗肿瘤效果，同时降低治疗毒性反应[38-39]。肥大细胞与STON1 表达呈正相关(r=0.556，P＜0.001)，目前已知多种实体瘤，例如甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌和默克尔细胞癌，它们较差的预后及瘤组织血管密度与瘤组织中的肥大细胞数量密切相关，肥大细胞也是造成多种血液肿瘤，例如不同种类的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和浆细胞瘤较差预后的主要因素之一[40]。此外，本研究揭示了在STAD中STON1表达与免疫检查点CD48、TIGIT、HAVCR2、VS2R、CTLA-4、PDCD1呈正相关。以上结果表明STON1 可能通过调节免疫微环境中的大部分免疫细胞来间接促进STAD的进展。

本文进一步分析了STON1在STAD患者预后中的作用。Cox 回归分析显示，除了常见的危险因素包括TNM 分期、病理分期、年龄、主要治疗结果外，STON1也是STAD患者的独立预后指标，并建立了基于STON1表达水平的列线图预测模型，对STON1 的1 年、3 年、5年OS分别进行预测，CI指数为0.711(95%CI=0.687～0.735)，校准图的预测概率与观测结果基本一致，说明模型有较好的预测性。该模型可以为STAD患者的预后预测和个体化评估提供一个新的切入点。此外，为了进一步分析STON1 的预后价值，本研究使用2个肿瘤学数据库进行了生存分析，结果表明在STAD 中STON1 高表达的生存率更差。为了验证STON1在胃癌中的表达情况，本研究借助HPA 数据库对胃癌组织进行免疫组织化学染色，结果显示胃癌组织中STON1蛋白质表达水平高于正常胃组织，进一步说明了STON1的高表达是胃癌患者预后不良的因素。

总的来说，本研究结果表明，STAD 中STON1 的高表达可能与肿瘤进展和较差的生存结果相关，且STON1 可能作为一种刺激因子来诱导肿瘤免疫系统的激活。该研究为了解STON1 在肿瘤微环境中的功能提供了新的见解。其次，本研究从STON1相关免疫调节因子的风险评分和临床参数中得出的综合列线图可用于预测STAD患者的生存。但本研究的局限性是缺少生存数据，缺乏外部验证，接下来预备进行细胞学功能研究来进一步验证STON1 在STAD 中的具体作用和分子机制。