禽腺病毒血清4型感染引起宿主炎症信号通路变化的研究进展

冯孝傲,赵 超,方 天,朱二鹏,岳 筠,文 明,3,程振涛,3*

(1.贵州大学 动物科学学院,贵州 贵阳 550025;2.贵州省动物疫病预防控制中心,贵州 贵阳 550008;3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵州 贵阳 550025)

禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是家禽心包积液-肝炎综合征(hydropericardium-hepatitis syndrome,HHS)的主要病原[1],能够引起多种家禽及野生禽类出现包涵体肝炎、心包积液、肾脏充血等病理变化[2]。FAdV-4属于禽腺病毒科、禽腺病毒属[3],具有43～46 kb的双链DNA基因组,编码许多结构和非结构蛋白[4]。其中结构蛋白包含24个纤突蛋白(Fiber)、12个五邻体(Penton)和240个六邻体蛋白(Hexon)[5],Fiber蛋白由N端尾部区域组成附着在Penton蛋白上,两者与病毒的复制和宿主免疫反应相关。自1987年FAdV-4在巴基斯坦首次暴发以来[6],该病毒随后在墨西哥、俄罗斯、日本、韩国、印度以及南美洲和中美洲等地区相继报道[7]。FAdV-4主要感染3～6周龄鸡,病死率可达80%[8],给国内外养禽业带来了巨大的经济损失。

信号通路是宿主受到病毒感染后对其产生反应的途径,本质是配体与受体特异性结合从而发生的一系列级联反应[9]。病毒感染后激活各种模式识别受体并触发其下游信号通路,通过这些受体的信号传导引发许多细胞因子的释放,炎症细胞因子的过度分泌诱导炎症反应,过度炎症又将进一步损害机体组织[10]。研究发现,FAdV-4可激活宿主的先天免疫反应[11],FAdV-4感染宿主后,激活相关的炎症信号通路,介导大量细胞因子产生,从而使机体损伤严重。目前,研究表明FAdV-4感染宿主后产生炎症、自噬等病理反应的相关信号通路主要有TLRs、NF-κB、JAK/STAT、UPR、Caspase-1、LXR-α、JNK/MAPK、STING和TNF通路等。本文对FAdV-4感染引起宿主的相关信号通路变化进行阐述,分析由FAdV-4感染引起机体信号转导通路变化而产生的一系列炎症反应,以期为进一步探索FAdV-4感染宿主诱导炎症等病理变化的分子机制研究提供思路和参考。

1 TLRs样受体信号通路

Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)是PRR家族的成员,其可以识别微生物病原体相关分子[12],在介导细菌、真菌和病毒等病原体感染的防御中发挥关键作用[13]。Toll样受体识别病毒感染时,能够检测到CpG DNA、dsRNA和ssRNA等不同形式的病毒核酸,激活宿主的抗病毒免疫反应,介导炎性细胞因子的产生[14]。病毒感染最初是通过RIG-I样受体或Toll样受体识别的,通过这些受体发出的信号会引发多种细胞因子的释放,包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等[15]。最近的一项研究报道,FAdV-4感染后细胞因子-细胞因子-受体相互作用通路和TLR信号通路都有参与进来,MyD88介导病毒诱导产生炎症反应[16]。目前,已鉴定出10个禽的Toll样受体,包括TLR1La、TLR1Lb、TLR2a、TLR2b和TLR3-5、7、15和21,而TLR1La、TLR1Lb、TLR15和TLR21是禽类所独有的。ZHANG等[17]研究发现FAdV-4感染鸡肝癌细胞(LMH)激活Toll样受体信号途径后,MAP3K7、CD86、TRAF6、TLR3、TRAF3、MAP-K10、IL12B、CD80、IL8、MEK2和MyD88等基因均上调,而IKBKE、MAP3K8、MAPK12、TLR5、TRIF和JUN等基因下调,表明先天免疫反应和炎症反应均被激活。应用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测到TLR2a和TLR3在体内24和48 h时上调,并且在24 h时显著上调,TLR5在肝脏中的3个时间点均下调,在12 h时显著下调。ZHAO等[11]发现FAdV-4感染鸡后,在不同时间点鸡的心脏、肝脏、脾脏中TLR1、TLR4、TLR21表达水平升高,而在感染后的早期时间点,法氏囊中除了TLR4大多数TLR基因的表达水平会下降。TLR21能够识别富含CpG结构的病毒DNA,通过MyD88激活Toll信号通路,以抵抗病毒的感染[18]。FAdV-4感染鸡后,肝脏和脾脏中TLR7的mRNA表达水平在1 d 时上调[4],在感染早期(36,72 h)所有TLR的mRNA表达水平在受感染鸡的肝脏中保持稳定。石勇丽等[19]将FAdV-4感染LMH细胞后,利用qPCR技术监测到TLR1a、TLR1b、TLR2a、TLR2b、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21 的mRNA表达水平均出现不同程度上调,且后期上调更为明显。

综上所述,Toll样受体识别病毒蛋白,诱导多种炎症相关细胞因子、趋化因子分泌水平上升从而加重炎症反应。FAdV-4感染激活宿主的TLRs样受体信号通路,诱导与TLRs表达相关的宿主先天免疫反应,提示TLRs通路在宿主抵抗FAdV-4感染的过程中起着关键作用。

2 NF-κB信号通路

核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是免疫发育、免疫反应以及炎症反应的关键调控因子[20]。NF-κB家族由5个成员组成:p50/p105(NF-κB1)、p52/p100(NF-κB2)、p65(RelA)、RelB和c-Rel,其中p50/p65异源二聚体最丰富,p50亚基的同源二聚体与抑制转录活性有关[21]。介导免疫应答是NF-κB信号通路发挥的重要生理功能之一。当机体受到感染后,需要启动NF-κB信号通路产生炎症反应并转录一些细胞因子来清除病原菌。FAdV-4 Fiber2与细胞核蛋白KPNA3/KPNA4相互作用调节转录活性以及促进蛋白质运输,激发宿主的先天免疫,激活p65通路从而引起炎症,表明可以通过抑制NF-κB通路来进一步抑制IL-1、IL-6和TNF-α细胞炎性因子的转录[22]。LI等[23]研究发现FAdV-4通过激活NF-κB信号通路,进而刺激IFN-γ和IL-Iβ等细胞因子的转录,上调MHCⅠα、MHCⅡβ和Ii基因的转录水平,触发宿主特定的细胞和体液免疫反应。加入NF-κB抑制剂PDTC以抑制NF-κB转录因子后,这3个基因的表达水平分别降低。表明FAdV-4感染后可以通过调控NF-κB信号通路进而调控MHC分子的表达,这项研究将有助于了解鸡体内的免疫反应和抗FAdV-4机制。崔淹鸽等[24]研究证明,FAdV-4感染鸡胚后NF-κB和NF-κBp65的含量极显著增加,表明NF-κB信号通路被激活,如果用107 μg绿原酸处理鸡胚,NF-κBp65的表达水平受到显著抑制从而降低IL-1β和TNF-α的表达水平。从中可以得出绿原酸具有抗病毒和抗炎作用,对后续鸡的相关炎症疾病防控有重要指导意义。

FAdV-4感染鸡胚和雏鸡后心肌组织会出现一定的炎症变化,IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性细胞因子的mRNA表达水平均显著提高[25],这些细胞因子有助于机体对抗FAdV-4的感染。IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子是机体产生炎症反应的重要介质,其中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的增加与NF-κB通路的表达激活有一定的关联性,提示这些炎性细胞因子的过度表达、分泌与心脏和肝脏炎症反应密切相关。

3 JAK/STAT通路

近年来发现,JAK激酶(Janus kinase,JAK)/信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)信号通路是一条在细胞内重要且普遍表达的转导通路[26]。在参与细胞增殖、炎症、分化、细胞凋亡、免疫调节、启动固有免疫和协调适应性免疫等许多关键生物学过程中至关重要[27]。JAK2对于细胞因子受体信号传导很重要,当激活后,JAK2激酶磷酸化STAT3,从而引起炎症[28]。有研究表明阻断JAK2/STAT3信号转导通路可以抑制炎症[29]。通过靶向JAK2/STAT3信号转导,干扰通路关键蛋白JAK2的磷酸化,从而阻断下游STAT3蛋白的磷酸化和活性[30]。精氨酸(ARG)是一种条件必需氨基酸,可以调节动物的炎症,缓解过度免疫反应的炎症,如早期哺乳期间通过颈静脉补充ARG可缓解奶牛的炎症[31-32]。有研究表明ARG可以抑制LMH中的FAdV-4复制[33],但目前尚不清楚ARG是否可以缓解FAdV-4诱导的炎症反应。最近,SILIN等[34]通过转录组学、qPCR和Western blot等技术证明FAdV-4诱导肉鸡肝脏发生炎症反应并激活了JAK2/STAT3通路,感染后IL-6、IL-1β、IFN-α、JAK和STAT等差异表达基因水平显著上调,此外,用ARG培养基处理FAdV-4感染的LMH细胞后其IL-6、IL-1β和IFN-α的mRNA表达水平和p-JAK2和p-STAT3的磷酸化值和灰度值均显著降低,使用JAK2抑制剂AG490处理后显著抑制FAdV-4诱导的p-JAK2及其下游p-STAT3的磷酸化水平,这些数据表明,ARG通过调节JAK2/STAT3信号通路减轻了FAdV-4诱导的炎症反应。综上所述,FAdV-4感染可以引起肉鸡肝脏发生炎症,ARG通过JAK2/STAT3途径在体内和体外下调FAdV-4诱导的炎症反应。本实验室前期研究证明了FAdV-4通过激活JAK/STAT信号通路减轻了心脏成纤维细胞炎症反应,这与SILIN等[34]的研究结果一致。提示后期可以研究JAK/STAT信号通路与炎症反应之间的关系,为FAdV-4感染的预防提供新的见解。

4 UPR信号通路

内质网应激(endoplasmicreticulum stress,ERS)发生时,蛋白质稳态会被破坏,这时错误折叠的蛋白质数量增加,从而产生一种特征性应激反应,称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)[35]。UPR信号转导主要的3条通路分别为PERK-eIF2α通路、IRE1α-XBP1s通路、ATF6通路[36]。病毒利用并劫持宿主细胞的ER来合成其蛋白质,这可能会破坏ER稳态,激活ERS,并可能随后激活UPR信号通路恢复ER稳态[37]。许多研究表明,一些病毒感染会引起ER的压力,可介导自噬,PERK和IRE1是研究最多的信号通路。PERK和eIF2α被磷酸化并抑制大部分细胞蛋白的翻译,从而缓解ERS早期的ER压力[38]。先前的研究已经确定了FAdV-4感染会引发LMH中的自噬。然而,由FAdV-4感染引起的ERS介导自噬这一潜在机制仍然未知。MA等[39]通过Western blot和透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、qPCR等方法证明在FAdV-4感染的LMH中UPR的主要标志物GRP78显著上调,这表明ERS和3个UPR信号通路均可以被激活;ERS通过PERK-eIF2α途径参与了FAdV-4诱导的自噬,还通过PERK介导的CHOP通路参与了FAdV-4诱导的自噬;用化学抑制剂或siRNA处理后,内源性PERK、PERK磷酸化、eIF2α磷酸化、GRP78和CHOP蛋白表达降低,此外,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化受到强烈抑制,相应地,Beclin-1和Hexon发生降解。

综上所述,FAdV-4可以通过PERK-eIF2α途径诱导自噬,影响病毒复制。通过该新机制,我们了解到FAdV-4感染诱导的自噬是由ERS介导的。这项研究结果为今后更好地了解自噬与FAdV-4感染相关的分子机制的研究奠定了基础,并为今后开发抗病毒药物提供了依据。

5 Caspase-1 信号通路

NLRP3炎症小体是先天免疫中的重要参与者,介导IL-1β和IL-18的分泌,主要存在于包括巨噬细胞在内的免疫和炎症细胞中。NLRP3炎性体寡聚化后形成NLRP3、ASC和pro-Caspase-1复合物,并将pro-Caspase-1转化为其活性状态[40]。活化的Caspase-1通过将pro-IL-1β和pro-IL-18切割成生物活性形式来介导IL-1β和IL-18分泌[41]。Caspase-1主要在巨噬细胞和树突细胞中被激活。高毒力FAdV-4感染会诱导炎症损伤,同时在多种器官中分泌高水平的IL-1β[16]。为了研究高毒力FAdV-4诱导的IL-1β分泌机制,WANG等[42]用高毒力FAdV-4刺激鸡巨噬细胞系HD11,结果发现高毒力FAdV-4刺激首次激活了NLRP3炎性体,siRNA敲低和过表达Caspase-1的重组质粒转染到HD11细胞中,进行刺激,发现敲低Caspase-1导致IL-1β的分泌显著减少,Caspase-1的过表达不会显著影响HD11中分泌的IL-1β量。HD11细胞与Caspase-1的活性抑制剂Ac-YVAD-CHO孵育,然后用FAdV-4刺激,结果IL-1β分泌量显著下调,表明鸡Caspase-1直接介导IL-1β分泌及其功能与哺乳动物一致[43]。高毒力FAdV-4处理的HD11中IL-1β的上调依赖于NLRP3和Caspase-1,为FAdV-4感染引起的炎症损伤提供了新的见解。

6 LXR-α信号通路

肝脂肪变性的特征是肝细胞中油滴(主要是甘油三酯)过度积累,导致细胞质内出现明显的脂滴[44]。肝X受体(liverX receptor,LXR)在调节动物脂质和胆固醇代谢有关的宿主基因表达中起主要作用,包含LXR-α和LXR-β两种且均已被识别[45]。LXR是肝脏脂肪酸生物合成的主要调节剂,它们通过甾醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)依赖和SREBP-1c非依赖性机制发挥作用[46]。许多感染肝脏的病毒可通过扰乱脂肪代谢的正常平衡而导致肝细胞脂肪变性。研究数据表明,细胞脂肪代谢途径通过不同的机制在肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒引起的肝细胞感染中起主要作用[47]。然而,迄今为止,还没有关于细胞脂肪代谢途径是否参与FAdV-4复制或在这种情况下激活哪些信号通路的报道。在FAdV-4感染的鸡中,FAdV-4诱导的肝损伤伴随着肝细胞质中油滴的积累,这是脂肪变性的典型指标。脂肪合成相关基因明显上调,例如LXR-α、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)和SREBP-1c,在受感染的鸡中观察到低密度脂蛋白分泌相关基因和脂质氧化和脂质分解相关基因的显著下调。为了研究LXR-α活化与FAdV-4诱导的脂肪变性之间的相互作用。YUAN等[48]采用FAdV-4感染鸡和LMH的试验,通过检测FAdV-4感染后肝组织中甘油三酯的持续积累,证明了FAdV-4诱导的肝细胞损伤与肝脂肪变性有关,通过qRT-PCR和Western blot等方法评估各种脂质代谢相关基因的mRNA合成和蛋白质表达水平,结果表明LXR-α、SREBP-1和PPAR-γ的mRNA合成和蛋白质表达显著上调,进一步表明,FAdV-4诱导的脂肪变性依赖于LXR-α信号通路在LMH中的激活,通过激动剂、拮抗剂或靶向LXR-α的siRNA,进一步确定FAdV-4诱导的LXR-α有助于病毒复制,并发现拮抗剂显著降低了FAdV-4子代病毒的产量,激动剂显著增加了FAdV-4子代病毒的产量。

这些结果表明,最佳的FAdV-4复制需要LXR-α通路的激活,证明了LXR-α激活对病毒复制和FAdV-4诱导的脂肪代谢信号通路的贡献。这些研究提供重要的机制见解,揭示了FAdV-4通过激活LXR-α信号通路诱导肝脂肪变性,并突出了针对LXR-α信号通路的策略治疗FAdV-4感染的治疗潜力。

7 JNK/MAPK信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路在细胞对外刺激的反应中发挥关键作用,包括增殖、分化、衰老等[49]。MAPK可分为6个不同的组即ERK1/2、ERK3/4、ERK5、ERK7/8、JNK1/2/3和p38α/β/γ[50]。P38MAPK由4种基因编码:α、β、γ和δ,p38MAPK的激活在细胞凋亡、细胞生长抑制和分化的调节中起着至关重要的作用[51]。激活的JNK可以调节许多细胞过程,包括细胞增殖、DNA修复、自噬、细胞凋亡和新陈代谢[52]。JNK/MAPK的激活是某些病毒感染状态的共同特征,这表明其可能是抗病毒治疗的重要靶点。HE等[53]发现JNK/MAPK特异性抑制剂SP600125可以显著抑制FAdV-4在LMH中复制,这表明JNK/MAPK可以作为抗病毒治疗的新靶点,此外,FAdV-4感染诱导p38或JNK/MAPK的磷酸化和Ⅰ型干扰素表达。这些数据表明SP600125可作为一种潜在的抗FAdV-4药物用于临床,表明JNK和p38MAPKs可能共享底物和跨级联相互作用。此外,SP600125作为一种JNK/MAPK抑制剂,可显著促进FAdV-4诱导的Ⅰ型干扰素表达,表明其可能会诱导一些DNA传感器介导的信号通路(如cGAS-STING通路)的激活,有待于进一步研究进行剖析。

8 STING信号通路

干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING),是干扰素Ⅰ型信号通路中重要的免疫连接分子,在先天免疫反应过程中至关重要[54]。近年来,研究发现鸡STING是参与抗病毒先天反应的关键分子,是病毒触发IFN诱导途径中的关键适配器,是导致IFN产生的开始。有研究表明,单纯疱疹病毒1型感染STING缺失小鼠和野生型小鼠后,基因缺失小鼠血清IFN-β水平明显低于野生型小鼠[55]。STING在先天性抗病毒反应和STING介导的信号传导调节中的重要作用已被广泛研究。一方面,病毒已经进化出复杂的机制来调节宿主STING介导的信号传导。例如,马立克病病毒Meq通过靶向STING来抑制Ⅰ型IFN的产生,从而阻止STING-TBK1-IRF7复合物的形成[56]。尽管许多编码基因已被证明可以改变STING介导的抗病毒信号传导,但关于鸡miRNA是否参与STING的调节尚不清楚。YIN等[57]利用转录组技术分析内源性miRNA在感染FAdV-4的LMH中的差异表达,在此研究中,FAdV-4诱导的gga-miR-181a-5p通过靶向STING并抑制NF-κB和IRF7信号传导来抑制Ⅰ型IFN和炎性细胞因子的产生,从而促进病毒复制,此外,STING过表达会抑制FAdV-4复制,而STING的敲除则促进了FAdV-4复制。一些研究发现,MAD5可以识别RNA和DNA病毒,并诱导Ⅰ型干扰素的产生,在这个细胞通路中,DNA病毒作用于MDA5并诱导STING通路刺激IRF7和MAVS的表达,从而调节IFN-β的表达[58]。LI等[23]用FAdV-4毒株感染鸡胚肾细胞后,发现FAdV-4毒株通过MDA5激活STING通路,刺激细胞因子IFN-β的表达,STING和NF-κB通路的激活上调炎症细胞因子(IFN-β、IFN-γ和IL-1β)、MHC分子(MHCⅠα、MHCⅡβ)和Ii基因的表达水平。

9 TNF信号通路

TNF-α的重要功能是能够调节复杂的炎症反应和免疫反应,在病毒感染期间,TNF-α可以激活和聚集中性粒细胞、巨噬细胞、细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞[59]。YU等[60]在研究体内和体外FAdV-4介导的肝细胞损伤的机制中,测量鸡肝脏和LMH细胞中TNF-α基因的mRNA表达,结果显示表达量与对照组相比显著上调有统计学意义(P<0.05),说明FAdV-4能够诱导肝细胞发生严重的炎症反应。

10 小结与展望

综上所述,当FAdV-4感染鸡或细胞时TLRs、NF-κB、JAK/STAT、UPR、Caspase-1、LXR-α、JNKMAPK、STING和TNF通路可被激活,各个信号通路之间互相关联、互相影响,转导机理复杂,研究FAdV-4感染宿主后相关炎症信号通路的发展过程有助于了解FAdV-4感染宿主诱导炎症的分子机制和致病机理,为HHS的治疗及预防提供一些思路和参考。例如FAdV-4感染后,Toll样受体信号途径被激活,诱导多种炎症相关细胞因子、趋化因子分泌水平上升从而加重炎症反应,这些结果表明TLRs在宿主抵抗FAdV-4感染过程中起关键作用。FAdV-4通过激活NF-κB通路,上调MHCⅠα、MHCⅡβ和Ii基因的转录水平,触发宿主特定的细胞和体液免疫反应。ARG通过调节JAK2/STAT3信号通路减轻了FAdV-4诱导的炎症反应。FAdV-4通过PERK-eIF2α途径诱导自噬,是由ERS介导的。高毒力FAdV-4诱导鸡巨噬细胞中IL-1β的上调依赖于NLRP3炎性体和Caspase-1,为FAdV-4感染引起的炎症损伤提供了新的见解。LXR-α通路激活有助于FAdV-4病毒复制,证明了LXR-α通路的激活对病毒复制和FAdV-4诱导的脂肪代谢信号通路的贡献,并突出了针对LXR-α通路的策略治疗FAdV-4感染的治疗潜力。此外,SP600125作为一种JNK/MAPK抑制剂,可以作为一种潜在的抗FAdV-4药物用于临床。FAdV-4诱导的gga-miR-181a-5p通过靶向STING并抑制NF-κB和IRF7信号传导来抑制Ⅰ型IFN和炎性细胞因子的产生,从而促进病毒复制。

然而,目前对HHS的研究多集中于FAdV-4对肝脏的致病机理研究,对炎症反应与炎症相关信号通路之间的互作关系研究较少。因此,对FAdV-4感染后宿主信号通路的变化进行研究是十分有必要的,这将有助于了解鸡体内的炎症反应和抗FAdV-4机制,揭示FAdV-4感染相关的分子机制并为开发抗病毒药物提供新思路。