中药复方对来航公鸡精液品质的影响

桂福星,仲崇华,黄 欢,杨萍瑞,林育霖,黄 月,李依然,柳 硕,毕师诚,4,曹立亭,4*

(1.西南大学 动物医学院,重庆 荣昌402460;2.云南农业大学 动物科学技术学院,云南 昆明650201;3.西南大学 动物科学技术学院,重庆 荣昌402460;4.西南大学 中兽医药研究所,重庆 荣昌402460)

来航鸡原产于意大利,是世界分布甚广的著名蛋用型标准品种,其性成熟早、产蛋量高、饲料消耗少,是优质种公鸡之一。繁殖性能是家禽业最重要的经济特征之一,精液品质是家禽业发展的重要保证,公鸡精液品质下降对孵蛋产生较大的负面影响,给鸡养殖业带来严重的经济损失。研究证实,微量元素硒、维生素、植物油、植物化合物和氨基酸及其衍生物等生物活性物质可提高种公鸡精液品质[1-2]。中草药具有多成分、多途径、多靶点、作用温和等特点,同时含有丰富的维生素、矿物质、挥发油、生物碱、多糖等物质[3],对减缓动物应激、调节内分泌与生殖机能有显著作用[4-5],谭千洪等[6]研究表明,中药复方添加剂能显著改善冷冻前后种公鸡的精液品质。JIANG等[7]研究也表明,中草药可改善精子活力和质量,增加精子数量并恢复正常激素水平,从而增加生育能力。根据中兽医基础理论及辨证论治法则,动物精液品质的下降,应属于肾阳亏虚、肾精不足,治宜补肾益精、益气补血[8]。本研究选取金元四大家之一的朱丹溪编著的《丹溪心法》中记载的“五子衍宗丸”为基础方进行加减化裁组方,探究其通过日粮添加对来航公鸡精液品质的影响,以期为中兽医药在提高公鸡精液品质的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物所用中药材均购自重庆市荣昌区步美松大药房。试验中药干燥后粉碎,过120目筛,按不同复方配伍混匀装袋密封,置于干燥处贮藏备用。

中药复方Ⅰ:五味子135 g,车前子135 g,覆盆子135 g,当归67 g,锁阳67 g,白术67 g,肉桂34 g。

中药复方Ⅱ:五味子116 g,枸杞子116 g,覆盆子116 g,肉苁蓉58 g,锁阳58 g,党参58 g,山药58 g,芦巴子58 g。

1.2 主要试剂总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(A015-2-1)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(A001-3-1)、丙二醇(MDA)检测试剂盒(A003-1-1)、谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒(A006-2-1)均购自南京建成生物工程研究所;RNAiso Plus(9109)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(RR047A)、TB Green®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(RR820A)试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.3 实验动物清洁级来航公鸡购自重庆市长水禽业发展有限责任公司。本研究经过西南大学实验动物伦理审查委员会审查批准(伦理审查号:IACUC-20211020-01)。

1.4 试验设计24只34周龄体况基本一致、健康状况良好的来航公鸡,平均体质量为(2.72±0.16) kg,随机分为3组,每组8只。空白对照组按常规饲养方式饲喂,中药复方Ⅰ,Ⅱ组在日粮中分别按每千克体质量添加10 g的中药复方Ⅰ,Ⅱ。预试期7 d,正式试验期70 d。试验鸡分笼饲养,饲喂全价饲料,自由采食和饮水。

1.5 生长性能指标检测分别于试验前和试验结束时称取鸡的体质量,同时记录每日采食量,计算平均日采食量和平均日增质量。

1.6 血清生化指标检测试验期末,采集试验鸡翅下静脉血1 mL,室温静置1 h后,3 000 r/min离心10 min分离血清,全自动血液生化分析仪检测血清生化指标。

1.7 脏器指数检测试验期末,处死所有试验鸡并精确摘取脾脏、肝脏、睾丸,计算脏器指数。

计算公式:脏器指数 = 脏器质量(g)/公鸡体质量(kg)。

1.8 精液品质的测定

1.8.1精液采集 采用背腹式按摩采精法[9]采集试验鸡精液,正常公鸡精液颜色为乳白色,比较浓稠,1次射精量为0.1～1.2 mL。采精前对公鸡尾部泄殖腔周围的羽毛进行修剪,以免污染精液。

1.8.2精子活力 参照文献[10]的目测法对采集的精液进行精子活力判定。

1.8.3精子密度 将采集的精液样品用3%NaCl溶液稀释200倍,吸取1 μL精液稀释液于细胞计数板上,在光学显微镜下计数。

计算公式:精子密度/(个·mL-1) = 5个中方格精子总数×5×10×1 000×稀释倍数。

1.8.4精子畸形率 采用伊红染液进行染色,在光学显微镜下观察,计200个以上精子数并统计畸形的精子数量。

计算公式:精子畸形率=畸形精子数/精子总数×100%。

1.9 精浆抗氧化性能将采集的精液样本1 500 r/min离心5 min,取上清,-20℃保存备用。按照试剂盒说明进行抗氧化指标的检测。

1.10 睾丸组织的基因表达睾丸组织液氮速冻后于-80℃保存备用,使用TRIzol法从睾丸组织中提取总RNA,按照PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa)说明合成cDNA模板。qRT-PCR扩增条件:95℃预变性30 s;95℃ 5 s,60℃ 31 s,40个循环;60℃ 1 min。以β-actin作为内参基因,结果采用2-△△Ct法计算。引物序列如表1所示。

表1 引物信息

2 结果

2.1 中药复方对公鸡生产性能的影响如表2所示,与对照组相比,中药复方Ⅰ,Ⅱ组平均日采食量、平均日增质量均无显著性差异(P>0.05)。

2.2 中药复方对公鸡血清生化指标的影响如表3所示,与空白对照组相比,中药复方Ⅰ组甘油三酯(TG)和血清乳酸脱氢酶(LDH)均显著降低(P<0.05),其余各项指标均无统计学差异;中药复方Ⅱ组各项指标均无显著性差异。

表2 中药复方对公鸡体质量和采食量的影响 g/d

2.3 中药复方对公鸡脏器指数的影响如图1所示,与对照组相比,中药复方Ⅱ组脾脏指数显著升高(P<0.05),肝脏指数和睾丸指数无显著性差异(P>0.05);复方Ⅰ组肝脏指数、脾脏指数和睾丸指数相较于对照组均有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。

表3 中药复方对公鸡血清生化指标的影响

不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.4 中药复方对公鸡精液品质的影响如图2所示,与对照组相比,中药复方Ⅰ,Ⅱ组精子密度分别提高了31.7%,33.9%,差异显著(P<0.05);中药复方Ⅱ组精子活力提高了10.5%,差异极显著(P<0.01)。各试验组公鸡精子畸形率无显著性差异(P>0.05)。

图2 中药复方对公鸡精液品质的影响

2.5 中药复方对公鸡精浆抗氧化性能的影响如图3所示,与对照组相比,中药复方Ⅰ组GSH极显著升高(P<0.01),中药复方Ⅱ组有上升的趋势,但差异不显著(P>0.05);各组间T-AOC、SOD和MDA含量均差异不显著,但中药复方Ⅰ,Ⅱ组SOD相较于对照组有升高趋势,MDA含量有降低趋势,差异不显著(P>0.05)。

图3 中药复方对公鸡精浆抗氧化性能的影响

2.6 中药复方对公鸡睾丸相关基因表达的影响如图4所示,与对照组相比,中药复方Ⅰ组公鸡睾丸AR基因表达水平极显著升高(P<0.01),Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.05),Bcl-2基因表达水平有升高趋势,差异不显著(P>0.05);中药复方Ⅱ组睾丸Bcl-2基因表达水平显著升高(P<0.05),Bcl-2/Bax比值有升高趋势,但差异不显著(P>0.05);各组间Bax基因表达水平差异不显著(P>0.05)。

图4 中药复方对公鸡相关基因表达的影响

3 讨论

有研究表明,中药及中药复方可显著提高公鸡精液品质,且安全性相对较高[2,6,11]。本试验中,与对照组相比,各组生产性能差异不显著,表明本研究所用中药复方不会影响公鸡健康生产。血清生化指标能客观反映机体脏器的健康状态、营养物质代谢正常与否以及动物的免疫水平等,TG与代谢相关,血清中LDH是检测动物机体肝脏和实质性内脏器官损伤的指标。邓翀等[12]研究表明,五味子可调节大鼠血脂代谢,减少血清TG水平。本试验结果显示,添加复方Ⅰ后公鸡血清中TG、LDH含量降低可能与五味子有关。据报道,中药复方可以促进小鼠器官发育,提高脾脏指数[13],本试验中复方Ⅱ组公鸡脾脏指数显著提高,说明中药复方对机体代谢有一定增强作用且不会对脏器造成损伤。

随着人工授精技术在家禽业的广泛应用,对精液优质程度的要求不断提高。精液品质的优劣主要从精子活力、精子密度和精子畸形率等方面综合判断,本试验中药复方Ⅰ,Ⅱ均能提高精子密度和活力,可显著提高来航公鸡的精液品质。研究证实,具有滋肾阴、补肾精、益精髓、壮阳作用的中药可提高动物精液的品质[14-15]。相关研究证实,五味子、车前子、覆盆子中富含锌(Zn)、硒(Se)等微量元素[16],Zn在生殖细胞发育和精子发生、精子细胞发育和成熟、射精、液化、精子和前列腺小体的结合、获能和受精的初始阶段起关键作用[17];Se对哺乳动物的正常精子发生至关重要[18]。

脂质过氧化是一种自然现象,对精子活力有显著影响,精子易受到氧化应激,对其运动性、膜完整性和受精能力等功能造成损害。精子和精浆含有许多具有抗氧化特性的化学成分,如SOD,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT),可以保护精子免受氧化损伤[19],MDA作为脂质过氧化的主要产物,可反映发生氧化应激的水平;研究表明SOD、GSH活性增加和MDA含量降低,间接反映精子的脂质过氧化反应减弱,可提高公鸡精液抗氧化性能,从而提高公鸡精液品质[15],本试验选用的中药复方显著提高了精浆GSH含量和SOD活性,同时降低了MDA含量,增强了精浆抗氧化性能,提高了精液品质,与相关研究报道相一致[20-21]。

公鸡睾丸雄激素受体(AR)是雄激素作用的中介物质,雄激素通过与AR结合而发挥其功能,AR基因的表达与睾酮生物合成和代谢相关,其表达上调可以间接反映公鸡的生精能力,AMEVOR等[11]研究发现,公鸡睾丸AR基因表达上调可提升公鸡精子形成能力,与本试验结果一致;Bcl-2与Bax是与细胞凋亡密切相关的基因,Bcl-2抑制细胞的凋亡,Bax与其作用相反,Bcl-2/Bax比值的变化可以调节细胞增殖和凋亡的平衡[22],当Bcl-2/Bax比值小于1时,生精细胞凋亡明显增加[23]。在本试验中,中药复方均提高了睾丸Bcl-2基因表达水平,复方Ⅰ组Bcl-2/Bax比值显著增加,可以使生精能力得到提升,结果与中药复方组精液品质检测中精子密度增加一致,提示中药复方可能通过调控生殖和细胞凋亡相关基因来提高公鸡精液品质。

综上,中药复方可通过提高脏器指数、精液密度、精子活力、精浆抗氧化能力以及睾丸AR和Bcl-2基因的表达水平,提高来航公鸡的精液品质。