基质金属蛋白酶7（MMP7）和硫酸乙酰肝素糖蛋白2（HSPG2）在胰腺癌中的表达及临床意义

陈金凤， 陆小柳， 张晓韵， 唐曦平

1 广西医科大学肿瘤医学院， 南宁 530021； 2 广西医科大学附属肿瘤医院内镜中心， 南宁 530021

胰腺癌起病隐匿，早期诊断难度大，并且发展迅速，恶性程度极高。目前为止，在全世界范围内还没有针对胰腺癌的具有良好治疗效果的药物，胰腺癌患者的5年生存率尚未得到显著改善，仍低于10%［1］。由于在早期诊断、预后、预测以及新的靶向治疗方面缺乏重大突破，胰腺癌的主要治疗方式仍为手术和化疗，但只有约10%的患者具有早期手术的机会，因此，筛选胰腺癌早期诊断的分子标志物已成为国内外的研究热点［2］。硫酸乙酰肝素糖蛋白2（HSPG2）是一种细胞外蛋白聚糖，与肿瘤血管的生成、增殖、分化和侵袭密切相关，且在多种肿瘤中呈高表达［3］。基质金属蛋白酶（MMP）是一系列结构相关的锌依赖性内肽酶，MMP7作为其中分子量最小的酶，在促进肿瘤浸润和诱导血管生成中起着关键作用［4］。研究［5］显示，MMP7能够对perlecan进行酶促加工，进而共同加速组织侵袭和血管生成。HSPG2在胰腺癌中的表达以及MMP7与HSPG2在胰腺癌中的关系尚未见相关研究报道。本研究通过检测胰腺癌患者组织和血清中MMP7及HSPG2的表达，同时对收集的患者临床资料进行回顾性分析，以探讨MMP7和HSPG2对胰腺癌诊断及判断预后的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年1月—2020年12月广西医科大学附属肿瘤医院收治的，病理检查证实为胰腺癌患者30例，其中男16例，女14例，年龄38～87岁。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期16例；高分化4例，中低分化26例。收集30例患者的胰腺癌组织及血清样本，并收集癌旁组织及30例健康志愿者血清样本作为对照。收集相关临床资料，随访时间截至2022年12月，回访采用门诊或住院复查的形式，配合电话随访，共随访1～39个月，以患者死亡作为随访的终点事件。

1.2 主要试剂及材料 HSPG2和MMP7多克隆抗体购自上海生工生物工程有限公司，免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。MMP7和HSPG2酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒购自上海酶联生物公司。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫组化法检测组织中HSPG2和MMP7表达 收集医院石蜡包埋标本，切片后常规脱水脱蜡，进行抗原修复、封闭，依次加入一抗、二抗孵育后DAB显色，苏木素染色，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片保存。免疫组化结果由两位病理科医师采用双盲法判定阳性。

1.3.2 免疫组化染色评分 显微镜下随机选取5个高倍视野进行评分。采用半定量积分法［6］综合染色强度和阳性细胞百分比判断结果。染色强度评分：无染色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。阳性细胞百分比：0～5%计为0分，6%～25%计为1分，26%～50%计为2分，＞50%计为3分。免疫组化评分=染色强度评分×阳性细胞百分比评分，总分≤4分为阴性，总分＞4分为阳性。

1.3.3 ELISA法检测血清中HSPG2、MMP7含量取-80 ℃保存的血清样品解冻，HSPG2和MMP7严格按照ELISA试剂盒说明书方法进行检测。酶标仪以450 nm波长读取各孔吸光度，绘制标准曲线，计算出各样品HSPG2和MMP7含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料以表示，两组间比较采用成组t检验。计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。MMP7与HSPG2表达的关系采用Spearman相关分析。采用Kaplan-Meier法分析MMP7和HSPG2不同表达情况下的生存率，并绘制生存曲线，生存情况比较采用Log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MMP7和HSPG2在胰腺癌及癌旁正常组织中的表达 免疫组化结果显示，MMP7和HSPG2表达均主要定位于细胞质中，阳性表现为肿瘤细胞胞质染色呈淡黄色至棕褐色（图1）。30例胰腺癌患者组织切片中，HSPG2蛋白阳性表达的有22例（73.33%），在癌旁组织中仅1例阳性表达（3.33%）；MMP7蛋白阳性表达的有25例（83.33%），在癌旁组织中仅2例阳性表达（6.67%）。MMP7、HSPG2蛋白阳性表达在胰腺癌和癌旁组织中差异均有统计学意义（P值均＜0.05）（表1）。

表1 MMP7和HSPG2在胰腺癌及癌旁正常组织中的阳性表达Table 1 Positive expression of MMP7 and HSPG2 in pancreatic cancer and normal adjacent tissues

图1 胰腺癌组织及癌旁正常组织中MMP7、HSPG2的表达情况（免疫组化，×200）Figure 1 Expression of MMP7 and HSPG2 in pancreatic cancer tissues and in adjacent cancer normal tissues（immunohistochemistry， ×200）

2.2 MMP7和HSPG2表达与胰腺癌临床病理特征的关系 收集患者临床资料进行回顾性分析，结果显示，胰腺癌患者MMP7和HSPG2阳性表达在肿瘤直径和TNM分期的差异均有统计学意义（P值均＜0.05）（表2）。

表2 HSPG2和MMP7表达与胰腺癌临床病理特征的关系Table 2 Relationship between HSPG2 and MMP7 expression and clinicopathological features of pancreatic cancer

2.3 MMP7和HSPG2表达的相关性分析 Spearman相关性分析结果显示，MMP7与HSPG2之间的表达呈正相关（r=0.539，P＜0.05）（表3）。

表3 HSPG2和MMP7表达的相关性分析Table 3 Correlation analysis of the expression of both HSPG2 and MMP7

2.4 各组血清中MMP7和HSPG2水平比较 胰腺癌患者血清中MMP7、HSPG2水平均高于健康对照组，差异均有统计学意义（P值均＜0.05）（表4）。

表4 各组间血清中MMP7、HSPG2的表达水平比较Table 4 Comparison of expression levels of MMP7 and HSPG2 in serum between groups

2.5 MMP7和HSPG2表达与胰腺癌患者预后的关系 采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，结果显示MMP7和HSPG2阳性表达胰腺癌患者的总体生存率低于阴性者，差异均有统计学意义（χ2值分别为4.084、12.554，P值均＜0.05）（图2）。

图2 MMP7、HSPG2蛋白表达与胰腺癌患者生存时间的关系Figure 2 Relationship between MMP7 and HSPG2 protein expression and survival time of pancreatic cancer patients

3 讨论

胰腺癌侵袭性高，全身转移时间早，是死亡率最高的肿瘤之一，在世界范围内发病率呈上升趋势［7-8］。分子生物标志物已越来越多地被用于协助诊断肿瘤疾病，鉴于胰腺癌的早期诊断以及治疗难度，探索新的生物标志物，可为胰腺癌的发生发展以及早期确诊提供新的理论依据和研究思路［9］。

MMP7属于基质金属蛋白酶家族，能够对细胞生长和血管生成的信号转导途径进行调控，在多种肿瘤的发生发展中起重要作用，并可作为多种癌症不良预后的预测因素［4］。已有相关研究表明，MMP7在结直肠癌［10］、胃癌［11］、乳腺癌［12］和前列腺癌［13］等多种肿瘤中具有显著的差异表达水平。本研究结果显示，MMP7在胰腺癌组织中的阳性表达与癌旁正常组织相比差异有统计学意义（P＜0.05），提示MMP7可能成为胰腺癌组织病理学诊断的潜在靶标。同时，本研究对胰腺癌患者的临床病理特征进行了回顾性分析，发现MMP7阳性表达与肿瘤直径、TNM分期密切相关，即MMP7在肿瘤直径较小、分期较早时已经表现为阳性表达，这可能与MMP7促进肿瘤细胞生长以及血管形成的作用有关，提示其可能在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。

HSPG2，也称为perlecan，是一种多功能蛋白聚糖，由1个核心蛋白和3个长链的糖胺聚糖组成，是基底膜和细胞外基质的重要组成部分，并参与多种生物活性［14］。HSPG2可影响多种信号通路，从而发挥其在机体内的调控作用，相关研究［5，15-17］表明，HSPG2可以调节细胞生长、增殖和分化，细胞外基质黏附，促进血管生成与生长，参与组织发育和伤口愈合等生物学过程。Kazanskaya等［15］研究表明，HSPG2在胶质母细胞瘤表达上调，通过影响肿瘤微环境来促进肿瘤发育，并与患者的预后不良和低生存率有关。但HSPG2在胰腺癌中的研究报道罕见。本研究结果显示，HSPG2在胰腺癌组织中表达升高（P＜0.05），与肿瘤直径、TNM分期相关，且MMP7与HSPG2表达呈正相关（r=0.539，P＜0.05），提示MMP7和HSPG2可能共同参与了胰腺癌的发生发展，但二者间的具体调控机制还需分子生物学等实验进一步验证。本研究结果还显示，胰腺癌患者血清中MMP7、HSPG2水平明显高于健康对照组，鉴于血清样本较易获取，对患者伤害较小，提示其有望成为早期检测胰腺癌的潜在标志物。生存分析结果表明，与阴性对照相比，MMP7和HSPG2阳性表达的胰腺癌患者的生存时间明显降低（P值均＜0.05），提示MMP7和HSPG2阳性表达对判断胰腺癌患者的预后具有一定的参考价值。

综上所述，MMP7和HSPG2在胰腺癌组织中呈阳性表达，两者间表达呈正相关，在肿瘤直径较小、TNM分期较早时即表现为阳性表达，且阳性表达患者总生存率更低；此外，MMP7和HSPG2在胰腺癌患者血清中水平升高，有望成为胰腺癌早期诊断和判断预后的潜在标志物。

伦理学声明：本研究方案经由广西医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审批，批号：LW2023010。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：陈金凤负责课题设计，资料分析，撰写论文；陆小柳、张晓韵参与收集数据；唐曦平负责提供经费支持，设计研究思路，指导撰写文章并最后定稿。