膝关节液炎性因子IL-1β、TNF-α表达水平与膝关节骨性关节炎K-L分级的关系

赵丹 王拴柱 李锐 王恒哲 裴晓东△

1)内蒙古科技大学包头医学院研究生院 包头 014040;2)内蒙古包头市第四医院关节外科 包头 014030

膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)为常见的膝关节慢性劳损性疾病,是一种长期、慢性、渐进的病理过程[1]。KOA的发病率约为8.1%,主要集中在中老年人群,40岁以上人群KOA的患病率约为17.0%,女性患者发病率高于男性,特别是女性绝经期后KOA的发病率明显增高[2-4]。随着我国进入老龄化社会,KOA的发病率逐年升高,目前已经成为威胁老年人群身心健康的常见疾病和关节外科的研究热点问题之一。X线片是观察骨关节形态学的主要检查手段之一,KOA病变的严重程度可依据影像学检查结果及临床表现等进行分级[5]。炎性细胞因子,特别是白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),主要由滑膜组织分泌,参与多种自身免疫性炎症反应和细胞活动。两者协同可引起膝关节软骨的损伤,在软骨退变和降解过程中起着重要作用;同时还可通过刺激疼痛通路生成介质前列腺素等,激活部分痛觉感受器后形成信号,从而引起疼痛感觉。对KOA的发生、发展至关重要[6]。本研究拟分析IL-1β和TNF-α在KOA患者膝关节液中的表达,并探讨两种细胞因子表达水平与K-L分级的相关性,为临床评估KOA的诊断与治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料回顾性分析2021-10—2022-06我院门诊及住院治疗的250例KOA患者的临床资料。病程3～24 a,均符合2018年颁布的《骨关节炎诊治指南》中的诊断标准[7],患者的认知及沟通功能正常。排除标准:(1)伴有严重内科疾病者。(2)合并类风湿性关节炎、风湿性关节炎、关节创伤、膝关节感染,或累及骨与关节肿瘤的患者。(3)入院前2周内发生局部感染者,或4周内有关节腔内注射药物(玻璃酸钠、几丁糖、糖皮质激素等)和服用激素史者。根据Kellgren-Lawrence分级分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。其中Ⅰ级组40例,Ⅱ级组55例,Ⅲ级组90例,Ⅳ级组65例。年龄(68.3±6.5)岁(范围:51～85岁)。4组患者的年龄、性别、穿刺部位等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。本研究符合医学伦理学要求,研究对象签署知情同意书。

表1 4组KOA患者的一般资料比较

1.2研究方法

1.2.1 KOA临床分级 详细询问患者病情及既往史,明确用药及治疗情况;行全面规范的体格检查,摄患肢负重位膝关节正侧位X线片。根据K-L分级标准并结合影像学表现,分为5个等级[8]。0级:膝关节正侧位X线表现基本正常。Ⅰ级:膝关节边缘出现骨性凸起,无关节间隙狭窄。Ⅱ级:膝关节边缘出现明显骨性凸起,关节间隙轻微狭窄。Ⅲ级:中度骨赘形成,伴明显关节间隙狭窄,形成软骨下骨硬化,可发生关节骨性畸形。Ⅳ级:骨赘大量形成,重度关节间隙狭窄,软骨下骨硬化,关节重度骨性畸形。

1.2.2 主要试剂和仪器 96孔IL-1β ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司),96孔TNF-α ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司),-80℃超低温保存箱(青岛海尔股份有限公司DW-86L626),低速台式离心机(上海尚仪 SN-LSC-1),电热恒温水浴箱(成都赛可隆有限公司 HH-501),全自动酶联免疫检测仪(山东恒美有限公司 HM-SY96S),移液枪,移液枪枪头,无菌离心管(5 mL、1.5 mL)。

1.2.3 标本采集方法 门诊患者坐于门诊处置室操作台上,患膝关节屈曲约30°。常规消毒、铺巾。取5 mL无菌注射器于髌骨下方髌韧带旁经皮行膝关节穿刺抽取关节液1～5 mL。住院患者完善术前准备,腰硬联合麻醉并收肌管神经阻滞。患者取平卧位。碘酒消毒患肢3遍、待碘酒干燥后,用75%酒精脱碘,常规铺无菌巾单。患肢驱血,放置气压止血带。取5 mL无菌注射器于髌骨下方髌韧带旁经皮行膝关节穿刺抽取关节液1～5 mL。将膝关节液置入离心管内,并在管上标明患者姓名、分组及编号。在低速离心机内放入编好号的膝关节液,设定转速为3 000r/min,离心20 min,分离并抽取上清液。将上清液分别置入2支1.5 mL无菌离心管内,再次于离心管上标明患者姓名、分组、编号及部位,并放置于-80℃低温冰箱内待测。操作过程严格遵循无菌原则。

1.2.4 检测方法 采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞因子IL-1β和TNF-α水平。操作步骤均严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1不同K-L分级患者膝关节液中细胞因子IL-1β和TNF-α表达水平各级患者膝关节液内的IL-1β、TNF-α含量差异均有统计学意义(P<0.05)。随着病情的不断进展,KOA患者膝关节液内IL-1β及TNF-α水平逐渐增高。见表2、图1～2。

图1 不同K-L分级患者膝关节液中IL-1β表达水平比较(ng /L)

图2 不同K-L分级患者膝关节液中TNF-α表达水平比较(ng /L)

表2 不同K-L分级患者膝关节液中IL-1β和TNF-α表达水平比较

2.2膝关节液中IL-1β和TNF-α表达水平与K-L分级的相关性KOA患者膝关节液IL-1β、TNF-α水平与K-L分级水平均呈正相关;膝关节液中IL-1β、TNF-α水平随K-L分级越高而逐渐增高。K-L分级与IL-1β、TNF-α比较,差异均有统计学意义(r=0.904、0.914,P<0.05)。见图3～4。

图3 膝关节液中IL-1β水平与K-L分级相关性

图4 膝关节液中TNF-α水平与K-L分级相关性

3 讨论

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种慢性关节疾病,主要特征为关节软骨退行性改变和继发性骨质增生,发病率为5.4%～13.7%;以缓慢进行性关节疼痛、肿胀、活动障碍和畸形,并伴有关节绞索、卡压,以及关节积液为主要临床特征;同时伴有骨质增生、滑膜炎等[9-10]。OA好发于膝关节、髋关节,以及远侧指间关节等,起病隐匿,进展缓慢,其中以KOA最为常见。

K-L分级是KOA目前应用最广泛的X线分级标准,也是一种直观、简单、有效的分级方法。K-L分级以关节间隙狭窄程度及有无骨质增生,对膝关节的病损状态进行评价,是膝关节综合功能的评分,可以直观反映KOA的严重程度,并与膝关节的疼痛程度具有一致性[11]。本研究中KOA患者的X线显示为非对称性关节间隙狭窄、软骨下骨暴露、出现囊性变及硬化、胫骨平台边缘及其间嵴出现大量骨质增生、髌上囊等部位内出现游离体;KOA后期关节间隙甚至消失,出现膝内翻或外翻畸形[12-14]。K-L分级通过膝关节正侧位负重位X线片检查结果,观察膝关节间隙狭窄、骨质增生,以及软骨下骨硬化程度等,并依据K-L分级高低反映KOA退变的严重程度。

IL-1β和TNF-α是影响KOA发生、发展的主要炎性因子。有关KOA研究发现,细胞因子具有调控软骨细胞基质的合成及分解代谢平衡作用。目前已发现有许多炎性细胞因子与KOA的发病密切相关,包括炎症介质通过被激活、诱导,凭借其相互间的共同作用,在KOA发病中起着关键作用。有关研究及实验表明,IL-1β可作为软骨代谢和软骨下骨代谢共同的细胞因子炎症介质,诱发炎症反应和软骨细胞分解,对KOA的发生、发展起重要作用[15]。IL-1β作为一种炎性递质,可以直接刺激软骨细胞对软骨基质产生破坏作用,抑制软骨胶原及蛋白聚糖合成,并加快两者降解,导致关节软骨及边缘骨质进一步破坏。TNF-α对软骨细胞和成纤维细胞均有影响,对骨破坏和软骨基质细胞降解有重要作用,能促进基质金属蛋白酶的释放,出现不可逆的细胞外基质损伤[16-17]。TNF-α还可抑制Ⅱ型胶原合成,刺激细胞外基质降解,促进内皮细胞增殖与迁移和破骨细胞分化,刺激成骨细胞、T细胞和成纤维细胞,从而恶性循环增强破骨细胞的增殖,并抑制成骨细胞的增殖,造成关节软骨破坏[18-19]。IL-1β还可促进TNF-α等其他细胞因子合成,增强TNF-α活性,产生协同作用,引发更多炎性因子生成,诱导关节软骨细胞组织的溶解及凋亡,进一步加重损伤和病情[20]。炎性因子IL-1β和TNF-α之间相互关联,既对机体的炎症反应有调节功能,同时又对KOA的病理发生、发展起到促进作用,并在膝关节软骨基质、软组织等的病变中发挥着至关重要的调节作用。

本研究应用ELISA法检测KOA患者膝关节液内IL-1β、TNF-α水平量,并排除了患者的一般资料(如性别、年龄、部位等)对本实验造成的影响。结果发现,随膝关节影像学表现的加重,患肢膝关节液内IL-1β和TNF-α的产生和聚集较前显著增加,证实KOA的轻重程度与IL-1β和TNF-α表达水平密切相关,并在KOA发病机制中起重要作用。炎性因子IL-1β及TNF-α可导致KOA患者膝关节软骨及边缘骨质破坏,造成软骨下骨硬化。KOA在影像学表现为膝关节间隙狭窄,关节边缘及髁间嵴骨赘形成,因此认为K-L分级与膝关节液内IL-1β、TNF-α表达水平存在相关性。

Attur M等[21]对111例有症状的KOA患者的研究中发现,血清中IL-1与KOA影像学表现的严重程度密切相关,血液中高水平IL-1可促使KOA进一步发展,表明了IL-1可作为预测KOA病情发展的标志性炎性因子。Özler K[22]比较了2组各42例Ⅲ、Ⅳ级KOA患者血清和膝关节液中TNF-α的水平,结果发现,血清和膝关节液中TNF-α在Ⅲ、Ⅳ级KOA患者的表达水平与KOA临床分级相关,膝关节滑膜炎症越严重,膝关节液中TNF-α的水平越高。本研究比较了无症状或临床症状较轻的轻中度KOA患者膝关节液内炎性因子水平,分析了在整个KOA病情进展过程中,炎性因子水平随影像学表现变化的情况,为KOA的早期诊断和干预提供了依据[23-24]。KOA炎症反应的发生需要多种促炎性细胞因子的参与,膝关节液内IL-1β和TNF-α表达水平可提示膝关节的炎性状态,同时也可以反映影像学表现和病情进展的急缓严重程度。因此,IL-1β和TNF-α在膝关节液中表达水平的高低可作为临床观察KOA疾病病情发展的一项重要参考指标。

综上所述,影响KOA发病机制的细胞因子及信号通路多且复杂,本研究受膝关节液取样方式、标本选择等因素影响,以及各期样本量的限制,而且仅针对其中两种较为主要的细胞因子进行研究,存在一定局限性和选择偏倚,故结论还需扩大样本量进一步开展多中心研究予以证实。