UPLC-PDA联合UPLC-MS/MS法确证一批标称杨树花口服液中非法添加物甘草酸

魏秀丽,张传津*,刘道中,李有志*,杨志昆,陈志强

(1.山东省饲料兽药质量检验中心;2.山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室;3.动物源细菌耐药性监测与精准化用药山东省工程实验室,济南 250022)

杨树花口服液是《中国兽药典》2020年版第二部中收载的产品,主要由杨树花经提取制成的合剂,功能化湿止痢,主治痢疾和肠炎,广泛用于马牛羊猪大动物和兔家禽[1-3];但2020年版《中国兽药典》杨树花口服液质量控制有薄层鉴别,没有含量测定项,容易被非法企业非法添加其他化合物。据贾纪萍和韩立等报道杨树花中含有丰富的黄酮类蒽醌类等物质[4-9],杨树花口服液中有多种有效成分:芹菜素、木犀草素、槲皮素和水杨苷、多糖、黄酮类、有机酸、强心甙、内酯及香豆素,蒽醌类化合物、甾醇、酚类或鞣质[10-12]等,均未见其含有甘草酸的报道。魏秀丽和龚旭昊[13-15]报道在杨树花口服液中检出过非法添加的黄芩苷,环丙沙星和乙酰甲喹等。由于标准本身不可能针对所有的添加物进行质量控制,所以需要检验人员熟悉杨树花口服液的图谱,并对处方外的成分进行辨识。本实验室在监督抽检兽药样品过程中,发现一批次标称杨树花口服液薄层鉴别不合格,而且检出了处方外成分。本研究使用UPLC-PDA联合UPLC-MS/MS法通过对比色谱图保留时间和光谱图的峰形结果及质谱图,来判定其非法添加物,以期为兽药监管提供依据和借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器 分析天平(感量0.01 g、0.00001 g, 瑞士Mettler公司);Waters AcquityTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司);AB 4000 Q TRAP液质(美国AB公司)。

1.2 药品及试剂 甘草酸对照品(含量94.4%,批号:110731-202122,中国食品药品检定研究院);乙腈、甲醇、磷酸(色谱纯, 德国默克公司);水为一级水自制。企业报批产品作为阴性对照样品;监督抽检产品:一批标称杨树花口服液。

2 方法与结果

2.1 超高效液相色谱-二极管阵列检测法色谱条件 色谱柱:waters T3色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm);流动相A:乙腈(0.1%磷酸);流动相B:水(0.1%磷酸),梯度洗脱;流速:0.35 mL/min;进样量:0.1-5 μL;柱温:40 ℃,进样室温度10 ℃。二极管阵列检测器,3D扫描范围:190-400 nm,检测波长为251 nm。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 液相梯度洗脱条件Tab 1 Gradient elution condition

2.2 超高效液相串联质谱法色谱条件 采用AB 4000 Q TRAP液质,waters BEH C18 色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流速0.3 mL/min,进样量1-5 μL;柱温40 ℃;流动相:A:乙腈;B:水;色谱洗脱条件如表2所示:

表2 液质色谱洗脱梯度Tab 2 Liquid chromatography elution gradient

串联质谱条件为:使用电喷雾离子源,负离子扫描模式,离子喷雾电压(IS): -4500V;离子源温度:550 ℃;气帘气(CUR):20 L/min;雾化气(GS1):55 L/min;辅助气(GS2):55 L/min。

离子对及质谱参数如表3所示:

表3 甘草酸母离子子离子及质谱参数表Tab 3 glycyrrhizic acid mother ion daughter ion and mass spectrometry parameter table

2.4 样品制备

2.4.1 阴性样品 报批样品作为阴性样品。

2.4.2 标准储备液及工作液的制备 精密称取甘草酸对照品约20 mg,置于50 mL量瓶中,加50%甲醇适量,置水浴中振摇使溶解,放置至室温,稀释至刻度,摇匀,即得约400 μg/mL的对照储备液,-20 ℃冰箱保存。

2.4.3 超高效液相色谱法工作液的制备 精密量取储备液适量,至10 mL容量瓶中,配置成200 μg/mL的工作液,4 ℃冰箱保存,用于超高效液相色谱的标准工作液使用。

2.4.4 超高效液相色谱-串联质谱法工作液的制备 取200 μg/mL的工作液用液相串联质谱方法中的初始比例流动相适量倍比稀释,得5、10、25、40、50、100 ng/mL的液相色谱串联质谱用的标准工作溶液。最终取浓度为25 ng/mL的甘草酸作为UPLC-MS/MS对照溶液。

2.4.5 阳性添加样品的制备 取杨树花口服液1.0 mL,加入甘草酸对照品溶液5 mL,置10 mL量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。重复配制6份,进样,计算甘草酸添加量和回收率平均值及相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

该课程中使用的形成性评价指标有：公司考勤、经营进度、过程正确率、经营能力提升度四个大类，每一个评价指标都在形成性评价过程中发挥着独特的作用。

2.5 提取净化方法

2.5.1 样品提取 精密量取空白样品、待测样品1 mL,置10 mL量瓶中,加50%甲醇适量,超声处理30分钟使溶解,放置至室温,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取滤液作为UPLC-PDA供试品溶液。

2.5.2 样品稀释 取适量母液,用初始流动相水:乙腈=(95∶5)稀释适宜倍数,用滤膜(0.22 μm)滤过,取滤液作为UPLC-MS/MS供试品溶液。(根据供试品UPLC-PDA测定的含量值,稀释适量倍数至约25 ng/mL的浓度,供超高效液相串联质谱上机测定,本批次杨树花样品多次稀释累计20000倍,上液质测定。)

2.6 方法线性考察及添加回收试验结果

2.6.1 UPLC-PDA专属性 在选定的色谱条件下,测得甘草酸色谱峰峰形良好,且均达到基线分离,在2.1项条件下,甘草酸对照品和杨树花口服液样品待测液,色谱保留时间为20.1 min左右,保留时间相差不超过+0.1 min; 分离度远大于1.5,理论塔板数达2.6-3.2×105,见图1-3,均满足检测要求, 纯度角和纯度阈值均满足要求,见表4。

图1 杨树花口服液样品UPLC色谱图Fig 1 UPLC chromatogram of Yangshuhua koufuye sample

图2 200 μg/mL甘草酸对照溶液色谱图(进样量0.1 μL)Fig 2 UPLC Chromatography of 200 μg/mL glycyrrhizic acid reference solution Injection volume:0.1 μL

图3 200 μg/mL甘草酸对照品溶液UPLC色谱图 (进样量1 μL)Fig 3 UPLC chromatogram of 200 μg/mL glycyrrhizic acid reference solution Injection volume 1 μL

表4 不同样品的色谱参数表Tab 4 Table of chromatographic parameters for different samples

本研究利用PDA检测器采集甘草酸的对照溶液光谱图,在波长190-400 nm范围内扫描,发现甘草酸在251 nm处有最大吸收,故选择251 nm作为两者的检测波长,光谱图见图4-5。

图4 甘草酸对照品溶液光谱图Fig 4 Spectrogram of glycyrrhizic acid reference solution

图5 杨树花口服液中甘草酸光谱图Fig 5 Spectrogram of glycyrrhizic acid inYangshuhua koufuye

而且待测样品色谱图中出现色谱峰与相应对照品主峰保留时间一致(差异小于等于±5%)。阳性添加样品的光谱图、色谱图与对照品和待测样品的图谱较一致,纯度角小于纯度阈值说明纯度高、无包裹共流出物,确证样品中添加了甘草酸。对照品和待测样品的纯度角纯度阈值图见图6-7,阳性添加样品的色谱图见图8,报批合格样品中不含甘草酸,色谱图见图9。

表8 甘草酸加样回收率试验结果Tab 8 Result of glycyrrhizic acid Sample Addition Recovery Test

进样量体积μL进样量ng峰面积0.120488710.240954270.510023841312004782722400964726510002417810

图6 甘草酸对照品溶液纯度阈值图Fig 6 Purity threshold of glycyrrhizic Acid reference solution

图7 杨树花口服液样品中甘草酸纯度阈值图Fig 7 Purity threshold of glycyrrhizic Acid in Yangshuhua koufuye

图8 杨树花口服液添加样品甘草酸色谱图Fig 8 UPLC Spectrogram of glycyrrhizic acid with positive addition sample of Yangshuhua koufuye

图9 杨树花口服液报批合格样品色谱图Fig 9 UPLC Spectrogram of Yangshuhua koufuye Samfor approval

2.6.2 UPLC-PDA方法标准曲线的绘制 精密吸取甘草酸对照品工作溶液适量,以不同的体积:0.1、0.2、0.5、1,2、5 μL进样,以进样量(μg)和峰面积响应值为X和Y,来绘制校准曲线。

甘草酸在20-1000 ng范围内,线性良好,对照曲线为y=2419.3537x-2423.9239,R2=1.0000 。对照曲线见图10.

图10 甘草酸对照曲线图Fig 10 Standard curve diagram of glycyrrhizic acid

2.6.3 UPLC-PDA方法的检出限和定量限 对甘草酸对照品溶液,倍比稀释成含甘草酸约5、10、20、50 μg/mL的溶液,进行UPLC分析,以溶液检测时的信噪比(S/N)分别大于等于3,且光谱图不失真为前提,结果20 μg/mL作为药物的检出限。以溶液检测时的信噪比(S/N)分别大于等于10,且光谱图不失真为前提,结果50 μg/mL作为药物的定量限。

2.6.4 UPLC-PDA方法的准确度和精密度 待测样品杨树花口服液,通过六次样品平行处理的检测,平均含量为0.528 mg/mL;添加量为0.964 mg/mL时,实际回收率平均值102.8%,变异系数0.32%,完全满足检测需求。

2.6.5 UPLC-MS/MS专属性 在质谱中,对照品和待测杨树花口服液中的甘草酸在5.87 min左右出峰,保留时间和两个定性离子对都非常一致,未知样品主成分进一步确证为甘草酸。稀释至含25 ng/mL左右的甘草酸待测样品溶液进样量1 μL,其特征离子质量色谱图见图11。甘草酸 821.5>351.0定量离子对保留时间5.87 min,峰面积1.148E4,峰高3.024E3,信噪比S/N为30.2;甘草酸821.5>193.2定性离子对保留时间5.87 min,峰面积3.795E3,峰高1.143E3, 信噪比S/N为11.4。

3 讨论与结论

3.1 如何初步判断发现处方外成分 近十年来,每年农业农村部下达的兽药监督抽检任务,都特别注重兽药中非法添加物的测定,并对兽药抽检的不合法生产企业进行重点监控、处罚甚至吊销生产许可。如何来判定其处方外添加了化合物,添加了何种化合物,是难点。所以我们查阅了大量的文献,杨树花药材中会含有丰富的黄酮类物质、多糖、氨基酸、植物甾醇等[4-9],杨树花口服液中韩立等曾报道含有蒽醌类、槲皮素、水杨酸等[10-12];曾经检出处方外不该含有哪些物质,如魏秀丽等报道[13-15]在杨树花口服液中检出过非法添加的黄芩苷,环丙沙星和乙酰甲喹等。采用报批合格的杨树花口服液作为阴性样品,观察其色谱特征图谱和光谱图,对比待测的抽检样品杨树花口服液的色谱峰和光谱图,并查看异常峰及其光谱图,我们发现了含量高的一个色谱峰光谱图与甘草酸光谱图一致,是特意处方外非法添加物。

3.2 如何初步确定处方外成分 UPLC-PDA方法中,在相同实验条件下,供试品色谱图中如出现色谱峰与相应对照品主峰保留时间一致(差异小于等于±5%)、在190-400 nm波长范围内,两者光谱图无明显差异,最大吸收处波长一致(差异小于等于±2 nm),则初步判为检出被测试药物为甘草酸。供试品色谱图中如出现与相应对照品保留时间一致的色谱峰,但小于检出限,判定为未检出被测试药物。

3.3 如何最终确证处方外成分 在UPLC-MS/MS方法中,通过母离子和子离子定量离子对和定性离子对的比较,进一步确证处方外非法添加物为甘草酸;由于样品稀释了20000倍,依然具有卓越的检测能力,其实与UPLC-PDA方法相比,大大提升了检出限和定量限,显示了液质的准确性和优越性。

综上所述,使用UPLC-PDA联合UPLC-MS/MS法检测本批次标称为杨树花口服液中的甘草酸,精准快捷、经济环保,能有效控制杨树花口服液的质量。而且这是本实验室首次发现杨树花口服液中非法添加甘草酸,以中国知网的搜索结果来看,暂时未发现相同的报道。