基于网络药理学方法探讨黄芪-半枝莲抗结直肠癌的作用机制

李静纯 龙其雄 冯峰 孙伟

1广州市花都区人民医院中心实验室，广州 510800；2广州市花都区人民医院消化内科，广州 510800

结直肠癌是全球第三常见的恶性肿瘤，病死率位居第二，尽管常规治疗有明显改善，但由于频繁复发和转移，5年生存率仍低于20%，而被诊断为4期结直肠癌患者5年生存率低于10%［1-3］。中国正处于癌症高发期，据数据统计，结直肠癌发病率迅速增加，且病死率高［4］。传统中医药在中国已被广泛使用数千年，由于中药具有较少的毒性作用被应用于多种疾病治疗［5］。大量数据表明中药是一种潜在的有效抗癌药物［6］，中药具有多成分、多靶点等特点，临床治疗大多以复方形式，有实验研究表明中药复方在抑制小鼠肿瘤生长的效果较单味中药好［7］。黄芪、半枝莲均具有清热解毒、抗炎抗癌等功效，但黄芪联合半枝莲抗结直肠癌的机制尚未阐明。随着生物信息的发展，网络药理学是代表一种基于“疾病-基因-药物”相互作用的网络关系方法，能系统从分子水平角度分析中药复方对疾病靶点的影响［8-9］。本文通过网络药理学分析方法探讨黄芪-半枝莲抗结直肠癌的有效成分及潜在分子机制，为中药复方治疗疾病提供依据。

材料与方法

1.黄芪-半枝莲有效活性成分筛选与蛋白靶点获取

通过中药药理学分析平台数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索黄芪、半枝莲成分，设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）值≥30，类药性（druglikeness，DL）值≥0.18，筛选有效活性成分以及相关作用靶点，利用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）对靶点进行匹配。

2.结直肠癌相关基因靶点获取

通过孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//omim.org/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）、治疗目标数据库（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/）和Drug-bank数据库（https：//www.drugbank.ca/）结直肠癌靶点，并且与药物靶点绘制韦恩图，筛选交集基因，即药物作用疾病的潜在靶点。

3.“药物-活性成分-潜在靶点”网络图构建以及分析

利用Cytoscape_v3.9.1软件绘制可视化“药物-活性成分-潜在靶点”网络图，通过软件中的Network Analyzer工具及cytoNCA插件分析对网络图每个节点进行分析，以3个参数为标准，分别为：（1）连接度中心性（degree centrality，DC）；（2）紧密度中心性（closeness centrality，CC）；（3）中介中心性（betweeness centrality，BC），DC值越高，BC值和CC值就越大，以此来筛选网络图中的关键节点，即活性成分中的关键成分。

4.构建蛋白相互作用网络图

将潜在靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/）构建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图，将PPI网络图导入Cytoscape_v3.9.1软件，使用cytoNCA插件计算各个靶点的DC、BC、CC值，最终筛选出核心靶点，并且用Cytoscape_v3.9.1构建关键成分与核心靶点网络关系图。

5.基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

将潜在靶点列表导入Metascape数据库（https：//metascape.org/），收集细胞生物进展（biological processes，BP）、细胞成分（cellular component）、分子功能（molecular function，MF）数据，同时对潜在靶点进行KEGG富集分析，制作富集分析图。

结果

1.黄芪与半枝莲有效成分及潜在靶点（表1）

表1 黄芪-半枝莲有效成分

通过TCMSP数据库检索黄芪与半枝莲的成分，将条件设置为OB值≥30且DL值≥0.18进一步筛选两者的有效成分，结果黄芪共筛出17种有效活性成分，半枝莲筛出28种有效成分，并且黄芪获得蛋白作用靶点463个，半枝莲获得589个作用靶点。将靶点与UniProt数据库进行匹配。

2.黄芪-半枝莲抗结直肠癌的潜在靶点（图1）

图1 黄芪-半枝莲抗结直肠癌的潜在靶点交集。A：黄芪；B：半枝莲；C：结直肠癌

通过GeneCards、OMIM、TTD和Drug-bank数据库检索结直肠癌相关靶点，共获取9 117个相关靶点，与黄芪-半枝莲作用靶点相互匹配后，交集得到24个共同靶点，即黄芪-半枝莲作用于结直肠癌的潜在靶点。

3.构建“黄芪/半枝莲-有效成分-药物靶点”网络关系图并且筛选关键成分（图2、表2）

图2 黄芪-半枝莲抗结直肠癌的“药物-活性成分-靶点”网络关系图

表2 DC值最高的前5种关键成分具体信息

利用Cytoscape_v3.9.1软件构建黄芪-半枝莲的有效活性成分与潜在靶点的关系图，通过Network Analyzer工具及cytoNCA插件分析网络图每个节点的DC、BC、CC值，筛选DC值最高的前5种关键成分。

4.PPI网络图构建以及核心靶点筛选（图3、图4）

图3 黄芪-半枝莲抗结直肠癌的蛋白相互作用网络关系图

图4 黄芪-半枝莲抗结直肠癌的关键成分与核心靶点网络关系图

将24个潜在靶点构建PPI网络图，并筛选出5个核心靶点，绘制关键成分与核心靶点关系图。

5.对潜在靶点进行GO富集分析（图5～7）

图5 基因本体论（GO）富集分析细胞成分条形图

图6 基因本体论（GO）富集分析细胞生物进展（BP）条形图

图7 基因本体论（GO）富集分析分子功能（MF）条形图

通过Metascape数据库对潜在基因进行GO富集分析，其中细胞成分富集到20项，BP富集到337项，MF富集到30项，选择其中P值最小的前20项以条形图进行展示。通过富集分析发现，黄芪-半枝莲抗结直肠癌主要作用于溶酶体、黑素小体、膜筏、微膜区、细胞质、细胞外基质、核膜、内质网、转录复合物等；生物进展方面，主要表现在对外界刺激反应、参与凋亡调控过程、调节酶活性等生物过程；分子功能方面，主要与蛋白激酶结合、转录因子结合、ATP依赖性活性、DNA结合转录因子结合等功能相关。

6.对潜在靶点进行KEGG信号通路富集分析（图8）

图8 京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集气泡图

通过Metascape数据库对潜在基因进行KEGG信号通路富集分析，共富集到89项，主要富集于小细胞肺癌、前列腺癌、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌等，信号通路主要富集于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等，选择富集程度最高的前20项绘制气泡图。

讨论

结直肠癌是全球第三常见的恶性肿瘤，病死率位居第二，中国正处于结直肠癌发病率迅速增加时期［1-2］。近年研究显示，中药是一种潜在的有效抗癌药物［6］，本文通过网络药理学分析方法系统阐述黄芪-半枝莲与结直肠癌靶点之间相互作用及潜在机制。通过网络药理学分析方法，能系统呈现中药的生物活性化合物与目标之间的相互作用，和各目标之间的交互作用，并找出关键节点，为中药复方治疗疾病提供理论依据［6］。

通过TCMSP平台我们检索到黄芪活性成分17种，半枝莲活性成分28种以及相关靶点。其中DC值最高的关键成分包括槲皮素、木犀草素、黄芩素等5种，槲皮素是一种水溶性糖苷，也是一种植物雌激素，能抑制结直肠癌发展，促进凋亡［10］；木犀草素是有效的抗癌类黄酮，通过调节细胞周期阻滞、凋亡和细胞增殖来达到抗结直肠癌效果［11］；黄芩素和汉黄芩素是从黄芩中提取的有效活性成分，能有效抑制结直肠癌细胞活性和转移，促进癌细胞凋亡［12-13］；山柰酚属于多酚类，能有效抑制结直肠癌生长，促进细胞周期进展并诱导细胞凋亡［14］。

通过韦恩图交集，分析PPI网络图，我们筛选出黄芪-半枝莲抗结直肠癌5个核心基因，包括MYC、TP53、基质金属蛋白酶（MMP）9等。MYC基因在肿瘤发生发展中发挥着核心作用，MYC基因失调与结直肠癌的侵袭性和不良预后相关，试验发现虫草素通过下调MYC表达从而抑制结直肠癌细胞增殖［2，15］。TP53基因是肿瘤抑制因子，具有调节细胞周期、DNA损伤修复等功能，对临床用药及预后监测具有指导意义［16-17］。Bian等［18］研究结果显示川芎嗪抑制结直肠癌细胞增殖，随着药物剂量性依赖可上调P53表达，阻滞细胞周期。MMP9基因是MMP家族成员之一，MMP9在各种肿瘤中表达以及活性显著上调，被认为是结直肠癌等肿瘤的潜在标志物［19］。Wang等［20］通过体内体外试验显示，华蟾素可显著下调MMP9的表达，明显抑制结直肠癌细胞侵袭和转移，抑制肿瘤生长。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物过程中发挥着重要作用，是PI3K/AKT/MTOR信号通路的一部分，刺激细胞恶性转化和肿瘤进展［21］。王璐等［22］通过研究发现，人参多糖可能通过下调PI3K/AKT信号通路抑制结肠癌发展，发挥对结肠癌的治疗作用。caspase蛋白酶家族在细胞凋亡中发挥重要作用。caspase缺乏与肿瘤发生密切相关，caspase3是caspase家族关键成员，在细胞凋亡执行阶段发挥着核心作用，可促进癌细胞凋亡并抑制肿瘤发展［23］。Feng等［24］结合网络药理学和试验研究发现当归补血汤抗结肠癌作用与细胞凋亡密切相关，通过上调caspase3、cl-caspase3蛋白表达水平，促进癌细胞凋亡，抑制疾病进展。综上分析，黄芪-半枝莲可能通过多个蛋白靶点发挥抗结直肠癌作用。

通过KEGG信号通路富集分析显示，主要涉及非小细胞肺癌、前列腺癌、结直肠癌等疾病通路，PI3K/AKT、MAPK和TNF信号通路等。PI3K/AKT是肿瘤相关重要通路，与癌细胞转移和上皮间质转化、耐药等相关，并且是细胞凋亡的负调控因子，一旦该通路被过度激活，将促进癌细胞增殖和转移，抑制凋亡［25-26］。Sheng等［27］通过试验验证半枝莲可减弱PI3K/AKT信号通路，从而抑制前列腺癌细胞增殖和转移，促进癌细胞凋亡。MAPK信号通路参与一系列细胞反应，包括细胞增殖、分化、炎症和凋亡，细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinas，ERK）、c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、P38激酶是MAPK信号通路关键蛋白［28-29］。在肿瘤发生过程中往往观察到ERK过度激活；P38与炎性反应、细胞凋亡和自噬有关，是肿瘤进展的抑制剂；JNK是一种应激激酶，在肿瘤细胞中主要参与细胞凋亡过程。大量试验证明ERK的激活与促进细胞增殖密切相关，P38和JNK的激活可促进炎症和细胞凋亡［28］。王加茹等［30］通过试验研究表明，隐丹参酮对食管癌细胞具有较好杀伤作用，促进p-JNK、p-P38表达，下调p-ERK表达，提示可能通过MAPK途径诱导癌细胞凋亡。TNF-α是一种调节细胞凋亡的炎性细胞因子，可能是肿瘤的抑制剂。Hsuan等［31］研究显示，山葵提取物可激活TNF-α，TNF-α与其相应的受体相结合，促进caspase3、caspase8、Bid等蛋白表达，进而促使结直肠癌细胞发生凋亡，抑制疾病进展。综合分析可知，黄芪-半枝莲可通过影响多条疾病通路、多条相关信号通路达到抗癌的效果

综上所述，基于网络药理学分析方法，对黄芪-半枝莲的抗结直肠癌作用机制进行系统分析，从理论基础上阐述黄芪-半枝莲抗结直肠癌是通过“多成分、多靶点、多通路”协同发挥治疗抗肿瘤效应，但仍需进一步进行体内体外试验研究，为临床治疗提供理论依据。

作者贡献声明李静纯：采集数据、分析/解释数据，起草文章；龙其雄：统计分析，指导；冯峰：指导；孙伟：对文章的知识性内容作批评性审阅，指导