昆明地区357 例Gilbert 综合征基因变异谱分析

何建萍 ，吕梦欣 ，秦茂华 ，朱丽虹 ，党峰博 ，孙永波 ，罗胜军 ，罗 兰 ，唐 健

（1）昆明市妇幼保健院医学遗传与产前诊断科，云南 昆明 650031;2）昆明医科大学基础医学院，云南 昆明 650500）

吉尔伯特综合征（gilbert syndrome，GS）又称Gilbert 综合征，是一种较为常见的家族遗传性先天血清高胆红素血症，由于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1）基因变异导致该酶活性部分或完全丧失，使得肝脏内非结合胆红素向结合胆红素的转化过程发生障碍，从而引起以非结合胆红素水平升高为主的临床综合征[1-3]。有研究表明[4-6]，UGT1A1基因变异谱在不同地区和人群间存在着明显差异。云南省位于我国西南边陲，其少数民族种类较多，奎莉越等[7]发现云南怒江、保山、临沧等边界地区非结合性胆红素血症发病原因与UGT1A1基因c.211G >A、c.1456T >G、c.1061C >T 等位点变异有关。而昆明地区人群中UGT1A1基因变异谱尚未见相关报道。本研究对357 例昆明地区GS 患儿进行高通量测序与生物信息学分析，探讨本地区人群中UGT1A1基因变异谱，为昆明地区非结合高胆红素血症疾病的诊断、预防及治疗提供参考依据，同时也为该疾病分子机制研究提供基础数据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选自2020 年4 月至2022 年12 月昆明市妇幼保健院诊疗的昆明地区出生的357 例基因型明确的Gilbert 综合征患儿，其中男性患儿243 例，女性患儿114 例，男女比例约为2.1∶1；患儿年龄1～33 d，平均年龄为17.44 d，样本年龄均数±标准差为（17.44±7.61）d；其临床症状有且不限于高胆红素血症、不明原因非结合型高胆红素血症、核黄疸、新生儿病理性黄疸、黄疸反复不退、黄疸消退延迟，皮肤重度黄染、肝功能异常等；共有临床症状均为黄疸类型。本项目通过昆明市妇幼保健院医学伦理委员会审核，伦理审核批号：昆妇幼伦审〔2020〕3 号，家属均充分知情后，签署知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA 提取采用深圳联合医学科技有限公司提供的磁珠法血斑&血卡基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 目标基因序列捕获及文库构建采用超多重PCR 扩增法，经扩增、纯化、再扩增、再纯化等方法后得到目标序列文库，使用Thermo Qubit Flurometer 3.0 荧光定量仪进行文库定量、Aglient2100 生物分析仪进行文库长度测定。

1.2.3 高通量测序采用Illumina NextSeq 550 测序仪进行高通量测序。

1.2.4 生物信息分析测序原始数据经碱基识别分析转化为原始测序序列文件，过滤去除低质量序列后获得有效测序数据，再采用BWA 软件与人参考基因组作比对，应用GATK 软件、ANNOVAR软件分析变异信息并注释。

1.3 统计学处理

数据采用统计学软件SPSS20.0 分析处理。其中计量资料数据采用均数±标准差（）表示；计数资料数据采用频数（n）、率或者构成比（%）表示。

2 结果

2.1 昆明地区357 例Gilbert 综合征基因变异情况结果

在357 例Gilbert 综合征患者中，检出UGT1A1基因纯合变异82 例。其中c.211G >A 纯合变异77 例，占UGT1A1基因纯合变异总数的93.9%；c.1091C >T 纯合变异3 例，占UGT1A1基因纯合变异总数的3.7%；c.1198A >C 纯合变异2 例，占UGT1A1基因纯合变异总数的2.4%。检出UGT1A1基因杂合变异275 例，其中c.211G >A杂合变异190 例，占UGT1A1基因杂合变异总数的69.1%；c.1091C >T 杂合变异为49 例，占UGT1A1基因杂合变异总数的17.8%；c.1456T >G 杂合变异15 例，占UGT1A1基因杂合变异总数的5.5%；c.1198A >C 杂合变异7 例，占UGT1A1基因杂合变异总数的2.5%；c.1352C >T、c.596C >G 杂合变异各3 例，各占UGT1A1基因杂合变异总数的1.1%；c.1423C >T 杂合变异2 例，占UGT1A1基因杂合变异总数的0.7%；c.1100G >A、c.1389G >C、c.610A >G、c.163C >T、c.715C >T、c.1021C >T 杂合变异各1 例，各占UGT1A1基因杂合变异总数的0.4%。Gilbert 综合征基因变异情况，见表1，Gilbert 综合征基因变异位点测序图，见图1。

图1 昆明地区357 例Gilbert 综合征基因变异位点测序图Fig.1 357 cases of Gilbert syndrome gene variant site sequencing diagram in Kunming

表1 昆明地区357 例Gilbert 综合征基因变异表Tab.1 Gene variation of 357 cases with Gilbert Syndrome in Kunming

3 讨论

Gilbert 综合征是由Augustine Gilbert 和Pierre Lerebullet 首先报道的一种先天性血清胆红素增高血症，其分子遗传学基础是由于UGT1A1 酶基因多态性导致[8]。UGT1A1基因变异导致尿苷二磷酸葡萄糖苷酸基转移酶蛋白水平下降，从而导致血清中非结合胆红素水平升高并引发相应的临床表现[9-11]。新生儿期出现不明原因非结合型高胆红素血症、核黄疸、新生儿病理性黄疸、黄疸反复不退、黄疸消退延迟，皮肤重度黄染等临床症状可能是GS 的早期表现，患儿临床症状多较为轻微，不引起肝脏器质性病变，易被误诊和漏诊[12]，早期诊断对患儿的及时治疗尤为重要。UGT1A1基因定位于2q37.1，目前已发现UGT1A1基因变异类型300 余种，其突变方式主要为缺失突变、插入突变及错义突变等[13]。随着分子生物学的飞速发展，高通量测序技术已在临床广泛应用，在新生儿期明确Gilbert 综合征基因变异情况，能为临床及时治疗提供诊断依据。

本研究对昆明地区357 例Gilbert 综合征患儿基因变异情况进行测序分析，检出的第1 顺位基因变异为UGT1A1基因外显子第211 位碱基由G变异为A，使编码氨基酸的密码子由甘氨酸（GGA）变为精氨酸（AGA）。该变异位点为功能性多态变异，在亚洲黄种人中最为常见，大多数患者症状不明显，主要表现为轻度黄疸，是一种间歇性、长期性的以非溶血性黄疸为病理特征的良性遗传性疾病[14-16]。检出的第2 顺位基因变异为UGT1A1基因外显子第1 091 位碱基由C 变异为T，使编码氨基酸的密码子由脯氨酸（CCG）变为亮氨酸（CUG），该变异为可能致病性变异，有研究表明该位点变异可使UGT1A1 酶活性下降[17-18]。检出的第3 顺位基因变异为UGT1A1基因外显子第1 456位碱基由T 变异为G，使该编码氨基酸的密码子由络氨酸（UAC）变为天冬氨酸（GAC）。该变异为致病性变异，有研究显示该位点发生纯合变异时，胆红素尿二磷酸葡糖醛酸转酶活性会降至正常水平的7.6%左右，导致非结合胆红素与结合胆红素的转化发生障碍，从而体内非结合胆红素升高[10]。综上，昆明地区Gilbert 综合征基因变异谱顺位前3 位为c.211G >A、c.1091C >T 和c.1456T >G 变异，与奎莉越[7]研究结果存在差异，提示昆明地区Gilbert 综合征基因变异谱与云南边界地区有所不同。

本研究检出的c.715C >T 变异与c.1021C >T变异均为致病性变异，c.715C >T 为无义突变，曾在致死性疾病Crigler-Najjar 综合征I 型中检出，当该变异发生纯合变异时，使编码氨基酸的密码子由终止密码子（TAG）替换了谷氨酰胺（CAG），导致胆红素尿二磷酸葡糖醛酸转酶失去功能，导致严重的非结合高胆红素血症[19]。c.1021C >T 变异则为巴基斯坦儿童持续非结合性高胆红素血症的UGT1A1基因变异中最常见的变异类型[20]，但在国内文献中报道较少。本研究检出的C.1198A >C、1352C >T、c.596C >G、c.1423C >T、c.1100G >A、c.610A >G 变异在人类基因突变数据库（the human gene mutation database，HGMD）与Clinvar 数据库中虽归于意义不明性变异，但也有研究[21]通过SIFT、Polyphen-2、Mutation Taster、PROVEAN、Mutation Assessor 软件预测这些变异可能致病，这提示该类变异有待于进一步随访观察其临床表现，探讨其是否具有致病性。

此外，本研究首次检出了c.1389G >C 及c.163C >T 2 种变异类型，HGMD 与Clinvar 数据库中尚未收录该变异位点，既往文献也尚无报道，该变异位点需进一步随访其临床表现，探讨其是否具有致病性。

综上所述，昆明地区Gilbert 综合征基因变异谱顺位前3 位为c.211G >A、c.1091C >T 和c.1456T >G 变异，与云南边境地区变异类型存在差异，并首次发现新变异类型。这为昆明地区非结合高胆红素血症疾病的诊断、预防及治疗提供了重要的参考依据，同时也为进一步探索非结合高胆红素血症的疾病发生机制提供了基础数据。