基于化学计量学及熵权TOPSIS分析联合多组分定量的麸炒苍术综合质量评价*

晏明英，魏谭军，赵 丹，魏 旭，陈 飞，王春龙，肖 成

（达州市中西医结合医院/达州市第二人民医院，四川 达州 635000）

苍术为菊科植物茅苍术[Atractylodes lancea(Thunb.)DC.]或北苍术[Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.]的干燥根茎，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效[1]。苍术临床应用广泛。麸炒苍术为苍术炮制品，是我院院内制剂神术合剂的君药。开展对麸炒苍术质量控制和品质评价研究对稳定神术合剂整体质量，确保临床应用疗效一致性具有重要意义。本研究收集江苏、浙江、湖北、河南、四川、云南6省18批次茅苍术药材，按照2020年版《中华人民共和国药典》一部苍术项下规定除杂，洗净，润透，切厚片，干燥，麸炒至表面深黄色制备麸炒苍术，采用HPLC法同时测定麸炒苍术中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、苍术苷A、β-桉叶醇、苍术素和苍术酮含量，并通过化学计量学结合熵权优劣解距离法（EW-TOPSIS）对不同产地来源的麸炒苍术进行质量评价，以期为麸炒苍术的安全性、有效性综合评价和内在质量的全面控制提供基础。

1 材料

1.1 主要药物与试剂 白术内酯Ⅲ对照品（批号：111978-201501）、白术内酯Ⅱ对照品（批号：111976-201501）、白术内酯Ⅰ对照品（批号：111975-201501）和苍术素对照品（批号：111924-202207）均购于中国食品药品检定研究院，质量分数分别为99.7%、99.9%、99.9%和99.9%；β-桉叶醇对照品（批号：PRF8112042）、苍术苷A对照品（批号：PRF21121721）和苍术酮对照品（批号：PRF22061641）均购于成都普瑞法科技开发有限公司，质量分数分别为97.1%、98.0%和98.0%；苍术素醇对照品（批号：Y54635）和(4E,6E,12E)-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯对照品（批号：B23334）均购于上海源叶生物科技有限公司，质量分数分别为95.0%和98.0%；苍术药材采集地信息见表1；乙腈、磷酸、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯；水为纯净水。

表1 苍术药材信息

1.2 主要仪器 LC-10AT型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；色谱柱为资生堂CAPCELL PAK C18柱、Agilent Extend C18柱、Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CP225D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；SB-1000YDTD型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、苍术苷A、β-桉叶醇、苍术素、苍术酮对照品适量，以90%甲醇为溶剂，定量制成上述9种成分的质量浓度分别为0.138、0.072、0.276、0.730、1.316、0.492、9.870、5.018和2.854 mg/mL的混合对照品母液；精密吸取该母液1 mL置20 mL容量瓶中，用90%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取粉碎的麸炒苍术粉末约2 g，精密称定于25mL容量瓶中，加入90%甲醇20 mL，超声处理45 min，常温放至室温，用同90%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.3 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK C18柱（250mm×4.6mm，5 μm），柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0～18 min，13%A；18～25 min，13%A→25%A；25～43 min，25%A→48%A；43 ～61 min，48%A→75%A；61～70 min，75%A→13%A）；检测波长：220 nm（0～25 min检测白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ）[2-4]、270 nm[25～43 min检测白术内酯Ⅰ、苍术素醇和（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯][4-9]、203 nm（43～70 min检测苍术苷A、β-桉叶醇、苍术素和苍术酮）[9-10]；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.4 HPLC方法学考察

2.4.1 专属性试验 取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，按“2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图。（见图1）结果显示麸炒苍术供试品溶液中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、苍术苷A、β-桉叶醇、苍术素和苍术酮9种成分的出峰位置与对照品基本一致，且阴性样品对麸炒苍术中多组分定量测定无干扰。

图1 混合对照品（A）和麸炒苍术（B）的HPLC 色谱图

2.4.2 线性关系考察 精密吸取混合对照品母液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL，分别用90%甲醇稀释至20 mL，摇匀制得系列混合对照品溶液1～6。取溶液1～6按“2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图，以对照品质量浓度（X）对峰面积（Y）进行线性回归，得线性回归方程。（见表2）

表2 麸炒苍术中各成分的线性回归结果

2.4.3 精密度试验 取麸炒苍术（编号：S1）供试品溶液1份，按“2.3”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算白术内酯Ⅲ等9个成分峰面积的RSD值分别为1.36%、1.50%、1.22%、1.31%、1.07%、1.22%、0.55%、0.83%、0.93%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取麸炒苍术（编号：S1）样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、5、9、14、20、24 h时，按“2.3”项下色谱条件进样，记录色谱图，9个成分峰面积的RSD值分别为1.39%、1.57%、1.23%、1.39%、1.14%、1.23%、0.55%、0.81%、1.02%，表明麸炒苍术供试品溶液24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验 取麸炒苍术（编号：S1）样品，按“2.2”项下方法制备麸炒苍术供试品溶液6份，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，用外标法计算9个成分的含量，各成分含量的RSD值分别为1.74%、1.89%、1.61%、1.69%、1.59%、1.63%、1.08%、1.19%、1.28%，表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取已知含量的麸炒苍术（编号：S1），粉碎，取细粉9份，每份约1 g，精密称定，分别按已知各成分含量的80%、100%、120%加入混合对照品溶液[每1 mL含白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、苍术苷A、β-桉叶醇、苍术素、苍术酮对照品分别为0.102、0.038、0.189、0.394、0.671、0.235、8.679、3.417、1.512 mg]，每个水平3份，再按“2.2”项下方法制备加样供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，计算加样回收率。9种成分的平均加样回收率分别为97.96%、98.22%、96.87%、98.44%、97.79%、99.11%、100.26%、97.87%、98.43%；RSD分别为1.50%、1.20%、0.76%、1.46%、1.54%、1.21%、0.58%、1.33%、1.65%。

2.5 一测多评法的建立

2.5.1 相对校正因子（f）的计算取“2.4.1”项下6个混合对照品溶液，以β-桉叶醇为参照物，按“2.3”项下色谱条件进样测定，依公式计算f。式中f为相对校正因子、ρ为质量浓度、A为峰面积、i为参照物、s为其他待测成分。结果见表3。

表3 麸炒苍术中8 种成分的f 值

2.5.2 相对校正因子（f）耐用性考察 选用液相色谱仪（LC-10AT型和Agilent 1260型）和色谱柱（CAPCELL PAK C18柱、Agilent Extend C18柱和Hypersil C18柱）。流速：（1.0±0.2）mL/min。柱温：（30±5）℃。分别考察仪器、色谱柱、流速和柱温的改变对f的影响。取混合对照品溶液依次进样检测，结果仪器与色谱柱、流速和柱温对所建立的f均无较大影响。结果见表4～6。

表4 不同仪器及色谱柱条件下检测的f 值

表5 不同流速下检测的f 值

表6 不同柱温条件下检测的f 值

2.5.3 相对保留时间的测定 取“2.1”项下混合对照品溶液，考察液相色谱仪（LC-10AT型和Agilent 1260型）和色谱柱（资生堂CAPCELL PAK C18柱、Agilent Extend C18柱和Hypersil C18柱）对相对保留时间值（t）的影响，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，采用t法对麸炒苍术中多组分色谱峰进行定位。结果各成分t值的RSD均≤1.74%，表明采用相对保留时间值法可以对麸炒苍术中多组分色谱峰进行准确定位。（见表7）

表7 不同仪器及色谱柱条件下检测的t 值

2.6 含量测定 取18批麸炒苍术（S1～S18），按“2.2”项下方法制备供试品溶液（每批平行制备3份），取各供试品溶液适量，依法进样测定白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、苍术苷A、β-桉叶醇、苍术素和苍术酮峰面积，采用ESM法计算麸炒苍术中9种成分的含量；再依据“2.5.1”项下所得相对校正因子采用一测多评法计算各组分含量。对各组分两种方法所得数据进行t检验。两种方法结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表8）

表8 麸炒苍术中9 种成分含量测定结果及比较 （n=3）

2.7 聚类分析 聚类分析可通过数据建模挖掘复杂数据间存在的关联性，对数据进行简化分类。以18批麸炒苍术中9种成分QAMS法含量检测数据为变量，将变量数据导入SPSS 26.0统计软件中，采用系统聚类法以Euclidean距离为样品度量标准进行分析。聚类分析树状图见图2。结果显示当Euclidean距离为10时，18批麸炒苍术样品呈明显的分类趋势，样品被分为3类：S9、S11、S12、S10和S8共5批样品聚为一类，S2、S5、S4、S6、S3、S1和S7共7批样品聚为一类，S14、S16、S15、S18、S13和S17共6批样品聚为一类。

图2 18 批麸炒苍术样品聚类分析树状图

2.8 主成分分析 主成分分析通过挖掘多个变量间的相关性，筛选出重要性较强的几个主成分，能尽可能多地保留原始变量的信息，以达到降维的目的。以18批麸炒苍术中9种成分QAMS法含量检测数据为变量构建9×18阶矩阵。采用SPSS 26.0统计软件中的降维方法对数据进行主成分提取，得各主成分方差分析表（见表9）和成分矩阵表（见表10）。选取特征值大于1的公因子为主成分，结果前2个主成分特征值分别为7.125和1.130，方差贡献率分别为79.163%和12.554%，累积方差贡献率为91.716%＞85%，表明前2个主成分因子能够解释91.716%的原始变量。

表9 麸炒苍术中2 个主成分因子的特征值和方差贡献率

表10 麸炒苍术中9 种成分的初始因子载荷矩阵

第1主成分主要反映白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、苍术素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、苍术苷A、β-桉叶醇、苍术素和苍术酮等成分的综合信息，第2主成分主要反映白术内酯Ⅰ的信息。（见表10）同时将9×18阶矩阵导入SIMCA 14.1统计软件建立PCA模型，提取2个主成分，结果模型稳定、可靠。18批麸炒苍术PCA得分图见图3。SIMCA 14.1和SPSS 26.0统计软件PCA结果与CA结果基本一致，S1～S7、S8～S12及S13～S18分别呈现一定关联性。

2.9 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA） 以18批麸炒苍术中9种成分QAMS法含量检测数据为变量，运用SIMCA 14.1统计软件挖掘引起麸炒苍术产品质量差异的主要潜在标志物，建立OPLS-DA模型。结果模型解释和预测能力较好，且稳定可靠。18批麸炒苍术样品的OPLS-DA模型得分图见图4。可见18批麸炒苍术样品明显分成3类：S16、S14、S17、S15、S13和S18聚为一类，位于得分图左下方；S7、S2、S3、S4、S5、S1和S6聚为一类，位于得分图中上方；S8、S10、S9、S11和S12聚为一类，位于得分图右下方。以变量重要性投影（VIP）＞1为筛选标准，筛选出引起麸炒苍术样品质量差异的主要潜在标志物，VIP值越大，表明该成分对麸炒苍术组间质量差异的影响越大。18批麸炒苍术各成分VIP图见图5。结果显示，β-桉叶醇（VIP=1.932 0）、苍术素（VIP=1.368 0）、苍术酮（VIP=1.034 0）和白术内酯Ⅰ（VIP=1.155 0）是影响麸炒苍术产品质量的主要潜在标志物。

图4 18 批麸炒苍术样品的OPLS-DA 模型得分图

图5 18 批麸炒苍术的VIP 图

2.10 EW-TOPSIS法分析 以18 批麸炒苍术中9 种成分QAMS法含量检测数据为变量建立初始化决策矩阵，采用越大越优型指标计算公式[Xij和Yij分别为原始含量数据和数据归一化后数据，max（xj）和min（xj）分别为各成分含量数据的最大值和最小值]对原始含量数据进行归一化处理。（见表11）以OPLS-DA分析中各成分的VIP值作为各指标权重（Wj），采用计算公式Zij＝Yij×Wj构建加权决策矩阵（见表12），得加权决策矩阵最优方案Z+j=0.196 0、0.137 0、1.155 0、0.476 0、0.783 0、0.308 0、1.932 0、1.368 0、1.034 0，最劣方案Z-j均为0。采用评价指标与正负理想解距离计算公式分别计算18批次麸炒苍术样品与正理想解距离（D+i）以及与负理想解的距离（D-i），再根据欧氏贴近度计算公式计算最优解的欧氏贴近度（Ci），即18批次麸炒苍术样品的综合评分。Ci排名前6位的依次为S16、S14、S15、S18、S17和S13，其中4批（S13～S16）来自江苏省，2批（S17、S18）来自浙江省，表明江苏和浙江地区所得麸炒苍术整体质量较佳。（见表13）

表11 18 批麸炒苍术各指标归一化处理结果

表12 18 批麸炒苍术加权矩阵

表13 18 批麸炒苍术药材质量评价排序

3 讨论

苍术资源分布广泛。茅苍术适宜高温、雨水充足、温度适宜的南方地区，主要分布于秦岭以南的江苏、浙江、湖北、河南、四川、云南等地；北苍术耐寒性强，喜冷凉，光照充足，喜昼夜温差较大气候，主要分布于秦岭淮河以北的黑龙江、吉林、辽宁、河北、内蒙古等地。苍术主要含有苍术素、苍术素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯等烯炔类成分，β-桉叶醇、茅术醇、苍术酮、苍术内酯等倍半萜类成分，以及寡糖、多糖、甾类化合等多种成分[11-12]。化学成分是中药产生生物效应的物质基础，活性成分含量及成分群之间的配比又与药材产地、地域环境、种属密切相关，不同产地、不同地域环境、不同种属造成中药材所含化学成分的种类和含量差异显著[13]，同时中药材炮制方法对产品质量也会存在影响[14-19]。而药材的质量决定疗效。中药的化学成分复杂，其药效并非是任何单一有效成分的作用，也不是几种有效成分的简单相加。成分间或协同或拮抗。苍术现收载于2020年版《中华人民共和国药典》一部，标准仅对苍术素进行了定量分析。单一化学指标进行的定量分析评价药材质量，易产生片面性，同时也达不到中医药理论的要求；多指标成分定量控制能更全面地表征药材的整体质量。化学计量学[20-22]及熵权TOPSIS[23-25]分析通过对多指标性成分设置权重系数，避免了主观因素造成的误差，能更加直观、客观地判断中药材的整体质量，故越来越多地用于中药材质量评价研究中。因此开展对苍术质量控制和品质评价研究对确保临床应用疗效一致性具有重要意义。

本研究在制备供试品溶液时，同时以色谱峰峰形、分离度、灵敏度为评价指标，分别考察了溶剂（50%甲醇、90%甲醇、甲醇）、提取方式（超声和加热回流）及时间（40、45、60 min）。结果显示90%甲醇超声提取45 min时得到的9种成分色谱峰峰形、分离度较好，灵敏度最佳。本研究通过对9个指标成分溶液进行全波长扫描，观察各成分光谱曲线中的最大吸收，结合《中华人民共和国药典》及相关文献，最终采用220 nm检测白术内酯Ⅲ和白术内酯Ⅱ，270 nm检测白术内酯Ⅰ、苍术素醇和（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯，203 nm检测苍术苷A、β-桉叶醇、苍术素和苍术酮。各成分在该条件下有较大吸收，峰形尖锐，麸炒苍术供试品溶液在该条件下检测时基线相对平稳，且各成分分离度良好。本试验在筛选流动相时，首先考察了甲醇-水和乙腈-水不同梯度洗脱程序，通过各洗脱程序下的色谱图比较，发现以乙腈-水系统为流动相效果较好，但个别色谱图拖尾严重，故考虑加入磷酸溶液（0.05%、0.10%、0.20%）进行改善，最终发现乙腈-0.10%磷酸溶液作为流动相系统时，洗脱效果最佳。

本试验采用HPLC法对18批麸炒苍术中白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅰ、苍术素醇、（4E,6E,12E）-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、苍术苷A、β-桉叶醇、苍术素和苍术酮进行定量测定，再结合化学计量学对检测结果进行分析。结果18批不同产地麸炒苍术呈明显的分类趋势，明显聚为3类，呈现一定的产区差异，且CA与PCA分析结果基本一致。OPLS-DA分析发掘出影响麸炒苍术产品质量的主要潜在标志物为β-桉叶醇、苍术素、苍术酮和白术内酯Ⅰ。EW-TOPSIS结果显示，江苏和浙江地区所得麸炒苍术整体质量较好，其次为河南、湖北、四川和云南产地所得麸炒苍术。

4 结论

本试验采用化学计量学联合EW-TOPSIS法和多组分定量法对不同产地的麸炒苍术质量进行了综合评价，建立的方法可操作性强，有效降低了检验成本，有利于多指标成分定量控制模式的普及应用，也为该药材的道地性研究提供了基础，进一步促进了苍术优质种源的研究与开发。