干姜中3种姜酚类成分提取工艺研究*

施丽君，杨韧强，严秋兰，阎光宇，蔡树芸，杨 婷，陈伟珠,，张怡评,

（1.自然资源部第三海洋研究所海洋生物资源开发利用工程技术创新中心，福建 厦门 361005；2.福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建 厦门 361021；3.厦门海洋职业技术学院海洋生物学院，福建 厦门 361100）

干姜（Zingiber officinaleRosc.）为姜科植物姜的干燥根茎[1]，其传统优质资源分布广泛。干姜始载于《神农本草经》，被列为中品[2]，具有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮的功效[3]。其主要含姜酚和挥发油等成分，可改善血液循环，对恶心呕吐、炎症、心脑血管系统疾病有较好的治疗作用[4]。姜酚是干姜的主要生物活性物质，其中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量较高[5-6]。6-姜酚具有镇痛、抗炎、抗菌、保肝利胆、抗氧化、改善心脑血管系统功能等多种药理作用。研究发现，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚可加强心肌收缩力，并对肿瘤细胞活性有明显的抑制作用[7-10]，并且其均具有β-羟基酮，结构不稳定[11-12]。这可对姜酚的提取、分离等研究造成影响，因此对姜酚的提取工艺考察具有一定的研究意义。目前尚未见干姜中以此3种姜酚成分为指标的提取工艺研究。故本研究以干姜中3种酚类成分为指标，采用超声辅助提取法，考察乙醇浓度、提取时间及料液比等因素对干姜中姜酚类成分提取工艺的影响，建立干姜中姜酚类成分最佳的提取工艺，旨在为干姜的进一步开发应用提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ-500E型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；ME104E型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DFT-200A型手提式高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

1.2 试剂与试药 干姜（批号：21090103）购自安国市一方药业有限公司，经福建中医药大学黄鸣清教授鉴定为姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的干燥根茎；6-姜酚对照品（批号：Y03D11Y132894）、8-姜酚对照品（批号：G24A10L96114）、10-姜酚对照品（批号：Z10701BC13）均购自上海源叶生物科技有限公司；乙醇（分析纯）购自西陇科学股份有限公司；无水乙醚（批号：20191017）购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

2 方法

2.1 色谱条件 Thermo BDS Hypersil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（72∶28）；流速为1 mL/min；检测波长为280 nm；柱温为25 ℃；进样量为10 μL。对照品与供试品色谱图见图1。

图1 HPLC 图

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称定6-姜酚对照品10.41mg、8-姜酚对照品10.36 mg、10-姜酚对照品10.32 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，混匀，即得质量浓度为1.04 mg/mL的6-姜酚对照品溶液、1.04 mg/mL的8-姜酚对照品溶液、1.03 mg/mL的10-姜酚对照品溶液。分别精密吸取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚对照品溶液各0.25 mL，再加入0.25 mL色谱甲醇补齐至1 mL，即得混合对照品溶液，放置4 ℃冰箱储藏，备用。

2.3 供试品溶液的制备 精密称定干姜粉末（过三号筛）2.0 g，置100 mL无塞锥形瓶中，加入一定量、一定体积分数的乙醇溶剂，称定质量，超声（功率：500 W）提取一定时间后取出再次称定质量，用乙醇补足减失的质量，摇匀，放置片刻后，取上清液，溶液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.4 单因素试验 采用超声辅助提取法提取干姜中的6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚，分别考察不同乙醇浓度、提取时间、料液比对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响。

2.5 响应面法优化提取试验 在单因素试验结果的基础上，根据响应面法Box-Behnken设计原理，以乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）3个因素为响应因子，对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的提取工艺进行优化，采用3因素3水平的响应面分析法进行试验，试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平表

3 结果

3.1 单因素试验结果

3.1.1 乙醇浓度对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响精密称取干姜粉末（过三号筛）2.0 g，置于100 mL锥形瓶中，分别加入40、50、60、70、80%的乙醇溶液，固定超声提取时间为40 min、料液比为1∶40（g/mL），提取结果见图2。结果显示，当提取时间与料液比固定时，随着乙醇浓度的升高，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率也随之升高。当乙醇浓度为40%～60%时对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响较为显著；当乙醇浓度为60%时，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率最高，为1.54%；当乙醇浓度超过60%时，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率反而降低，之后趋于平稳。这可能是由于较低浓度的乙醇进入组织细胞内较容易，可大量溶解液泡中的水溶性酚类物质；而高浓度的乙醇则容易破坏蛋白质的结构，使酚类物质的提取受到阻碍[13]。随着乙醇浓度的继续增大，提取出的其他杂质成分与乙醇-水分子结合，形成了竞争性抑制剂，从而导致6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率降低[14]。因此优选乙醇浓度为60%。

图2 乙醇浓度对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响

3.1.2 提取时间对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响精密称取干姜粉末（过三号筛）2.0 g，置于100 mL锥形瓶中，加入80 mL的60%乙醇溶液，分别超声提取20、30、40、50、60 min，提取结果见图3。结果显示，当乙醇浓度与料液比固定时，随着提取时间的延长，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率也随之增加；当超声提取时间为40 min时，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率最高，为1.48%；当超声提取时间为30～40 min时对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响最大，可能是因为超声提取时间过短，空化作用尚未发生完全，酚类物质尚为完全溶解，所以6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率不高[15]。当超声提取时间超过最佳提取时间时，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率下降并且趋于平稳，可能是因为超声提取时间太长，大分子酚类化合物在超声波的持久强烈作用下，化学结构遭受破坏，紧接着其他杂质成分也慢慢溶解，从而阻挡了姜酚的溶解使6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率不高[16]。因此优选超声提取时间为40min。

图3 提取时间对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响

3.1.3 料液比对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响精密称取干姜粉末（过三号筛）2.0 g，置于100 mL锥形瓶中，分别选取料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，加入60%的乙醇溶液，固定超声提取时间为40 min，提取结果见图4。结果显示，超声提取时间和乙醇浓度固定时，随着料液比的增加，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率也随之增加。当料液比为1∶30（g/mL）时，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率最高，为1.55%。料液比继续增加，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率则不再提高，趋于平稳略呈下降趋势。一般而言，料液比越大提取率越高，但达到一定值后，有效成分已提取完全，提取率则不再增加。而且料液比越大资源耗费越大，成本越高，操作也更不便[17]。综合考虑最终优选料液比为1∶30（g/mL）。

图4 料液比对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响

3.2 响应面试验结果

3.2.1 响应模型的建立与分析 采用Design-Expert 8.0.6软件，设计响应面优化试验方案得试验结果见表2。

表2 响应面优化提取干姜中姜酚的设计方案及结果

采用Design-Experts 8.0.6软件对表2所得数据进行二次多项式回归分析，得到干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率对乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）的回归模型方程为：6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率（%）=1.73+0.049A+0.024B+0.015C-0.040AB-0.023AC-0.0025-003BC-0.12A2-0.069B2-0.016C2。通过响应面试验得到的结果对干姜中姜酚提取工艺的回归方程进行方差分析。结果见表3。

表3 干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚提取工艺回归方程方差分析结果

根据方差分析表3可知，该方差模型F值为15.51，P值为0.0008，极显著，失拟项F值为3.1，P值为0.151 3，不显著。在此回归方程模型中，只有乙醇浓度的P＜0.05，说明存在显著性，其余两个因素P＞0.05，不存在显著性。二次项中，A2影响极显著（P＜0.001），B2影响显著（P＜0.05），C2影响不显著（P＞0.05）。校正模型的相关系数R2=0.9523，可知试验考察值和模拟预测值之间的相关性很高，表明该方程的模拟性较好。根据3种因素F值大小，可推断出影响6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率大小因素的排序为A＞B＞C。

3.2.2 响应面优化结果与分析 根据拟合模型绘制干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率各因素交互作用图见图5～7。图5～6显示明显椭圆形的等高线图，表明乙醇浓度与料液比、料液比与提取时间之间交互作用显著。图7只显示近似椭圆形的等高线图，表明乙醇浓度与提取时间之间仅呈交互作用，但是不显著。

图5 乙醇浓度与料液比对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的交互作用图

通过图5～7中响应面各因素交互作用图可知，在所选范围内存在响应面最高点。当乙醇浓度为61%，料液比为1∶34（g/mL）时，因提取时间充足使得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率最高。（见图5）当提取时间为41 min，料液比为1∶34（g/mL）时，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率最高，时间过短或料液比过高都不利于酚类物质的提取。（见图6）当乙醇浓度为61%，提取时间为41 min时，中等浓度的乙醇最适合姜酚的提取，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率最高。（见图7）

图6 提取时间与料液比对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的交互作用图

图7 乙醇浓度与提取时间对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的交互作用图

3.3 最佳工艺条件的确定与验证试验 通过响应面软件解出方程，得出最优化提取工艺：乙醇浓度为61.4%，提取时间为41.2 min，料液比为1∶33.6（g/mL），结合实际试验条件，将最优化提取工艺参数取整数得：乙醇浓度为61%，提取时间为41 min，料液比为1∶34（g/mL）。

采用确定的最优条件分别进行3组平行验证试验，通过验证得出3组平行试验的6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均总提取率为1.73%，该值与模型预测值1.74%基本一致，误差为0.57%，说明建立的模拟回归方程具有良好的预测性[18]，其优选出的最佳提取工艺重复性良好。

4 讨论

干姜资源丰富，但其主要成分的研究较单一，研究大多集中于占比较大的挥发油上[19-20]。姜酚研究主要集中于6-姜酚的研究，而8-姜酚、10-姜酚及其他姜酚的研究很少。这可能是由于6-姜酚占总姜酚的比例更大[21]，药理作用也十分广泛。本试验采用超声辅助提取法进行单因素试验，分别考察了乙醇浓度、提取时间、料液比对6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚总提取率的影响，经响应面法优化得到最佳提取工艺条件：乙醇浓度为61%，提取时间为41 min，料液比为1∶34（g/mL）。用HPLC测定3种姜酚的含量，结合响应面法优化最佳提取工艺，以最佳提取工艺条件进行3次平行试验，得到6-姜酚提取率为0.90%、8-姜酚提取率为0.30%、10-姜酚提取率为0.53%，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均总提取率为1.73%。