正交试验法优选蜜升麻的炮制工艺研究*

卞 理，李文强

（1.南通大学附属南通第三医院，江苏 南通 226000；2.南通三越中药饮片有限公司，江苏 南通 226371）

升麻为毛莨科植物大三叶升麻（Cimicifuga heracleifoliaKom.）、兴安升麻[Cimicifuga dahurica（Turcz.）Maxim.]或升麻（Cimicifuga foetidaL.）的干燥根茎。历代本草中记载有净制、切制、酒制、盐制、醋制、黄精汁制、姜汁制、炒黄、蒸制、焙、蜜炙11种炮制方法和品种，然而传承至今的仅有升麻、蜜升麻、升麻炭、酒升麻、炒升麻5种[1]。升麻生用升散作用甚强，以解表透疹、清热解毒之力胜；蜜炙后辛散作用减弱，升阳作用缓和而较持久，并且对胃的刺激性减弱[2-3]。

2020年版《江苏省中药饮片炮制规范》[4]规定，蜜炙后升麻中酚酸类化合物异阿魏酸含量应比生品升麻高，但实验研究和生产实际表明，与升麻生品比较，蜜升麻中异阿魏酸含量明显降低[5]。经蜜炙后，升麻中异阿魏酸的含量会发生改变，这对于升麻质量检测、药用价值和临床疗效都有很大影响。为尽可能地降低这种变化，以保证其质量和药效，本研究通过正交试验，以加热温度、加热时间、闷润时间作为考察因素，每一因素设4个水平，以蜜升麻中的异阿魏酸含量、性状外观评分的综合评分作为指标进行考察，确定蜜炙法炮制升麻的最佳炮制工艺，以期为蜜升麻的炮制生产及炮制工艺的研究提供指导意义和数据支持[6-9]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 BT125D型十万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；FA2004型万分之一分析天平（上海舜宇恒平科学仪器仪器）；AP-01P型真空泵（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；Uitimate3000型高效液相色谱仪（赛默飞Thermo Fisher Scientific）；YFR-3503型电磁炉（佛山市俏厨电器有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；IC101型电热鼓风干燥箱（南通仪器嘉程有限公司）。

1.2 药物与试剂 升麻饮片（批号：220411，产地：黑龙江）购自黑龙江国药药材有限公司，经南通市食品药品监督检验中心龚旭东主任中药师鉴定为兴安升麻[Cimicifuga dahurica（Turcz.）Maxim.]的干燥根及根茎。异阿魏酸对照品（批号：111698-201904，纯度：99.3%）购自中国食品药品检定研究院；三氯甲烷、甲醇、乙醇均为分析纯，乙腈为HPLC级（≥99.9%），磷酸为优级纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；水为屈臣氏纯净水。

2 方法与结果

2.1 蜜升麻的制备 取炼蜜约62.5 g用适量开水稀释，加入升麻饮片250 g，搅拌均匀，闷润60 min。电磁炉炒药锅进行预热，加热温度为100 ℃时倒入闷润好的升麻饮片，计时并不停翻炒，炒至90 s时取出，晾凉[10]。

2.2 异阿魏酸的含量测定

2.2.1 色谱条件 Syncronis C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸水（75∶25），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃；检测波长为321 nm，进样量为10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取异阿魏酸对照品5.06 mg置于25 mL容量瓶中，加10%乙醇稀释至刻度线，超声处理30 min，得到质量浓度为202.40 μg/mL的异阿魏酸对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取蜜升麻粉末（过二号筛）约0.5 g，置具塞锥形瓶中，用移液管精密加入10%乙醇25 mL，密塞，称定质量，100 ℃水浴加热回流2.5 h，取出，在冷水中放冷，再称定质量，用胶头滴管滴加10%乙醇补足减失的质量，摇匀，用玻璃漏斗和滤纸过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 系统适用性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果见图1。异阿魏酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数按异阿魏酸计算不低于5 000，说明在选定的色谱条件下，测定效果良好。

图1 HPLC 图

2.2.4.2 线性关系考察 精密吸取质量浓度为202.40 μg/mL异阿魏酸对照品溶液适量，依次稀释成质量浓度为0.81、2.02、4.05、8.10、20.24、101.20、202.40 μg/mL的对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积值。以异阿魏酸对照品的质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，回归方程为Y=4 542.25X+1 052.1（r=0.999 8），表明异阿魏酸在0.81～202.40 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2.4.3 精密度试验 精密吸取“2.2.3”项下供试品溶液，连续进样6次，每次10 μL，记录峰面积值。结果峰面积的RSD值为0.56%，表明仪器精密度良好。

2.2.4.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24 h进样，每次10 μL，记录峰面积值。结果峰面积的RSD值为0.78%，表明供试品在24 h内稳定。

2.2.4.5 重复性试验 取蜜升麻粉末，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积值。结果峰面积的RSD值为1.45%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.6 加样回收率试验 取蜜升麻粉末6份，每份约0.25 g，精密称定，分别加入精密量取的一定体积异阿魏酸对照品溶液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积值。结果异阿魏酸的平均加样回收率为101.50%，RSD值为1.66%，表明该方法准确度良好。（见表1）

表1 异阿魏酸加样回收率试验结果 （n＝6）

2.3 正交试验

2.3.1 正交试验设计 取16份升麻饮片，每份250 g[11-12]。按“2.1”项下方法制备蜜升麻。以蜜升麻的异阿魏酸含量和性状外观评分的综合评分为指标，选择加热温度（A）、加热时间（B）、闷润时间（C）3个指标作为考察因素，每一因素设4个水平，设计正交试验。蜜升麻工艺因素水平表见表2。

表2 蜜升麻工艺因素水平表

2.3.2 考察指标

2.3.2.1 异阿魏酸含量 按照“2.2”项下异阿魏酸含量测定方法进行测定，结果见表3。

表3 蜜升麻工艺正交试验结果

2.3.2.2 性状外观评分 参照1988年版《全国中药炮制规范》[13]蜜升麻“性状”项下规定：形如升麻片，表面黄棕色或棕褐色，味甜而微苦。将性状外观评分标准确定为：黄棕色或棕褐色有光泽为9～15分，黄色或深棕褐色略有光泽为4～8分，黄白色或棕黑色无光泽为1～3分；不粘手为9～15分，略粘手为4～8分，粘手为1～3分；蜜味浓为7～10分，有蜜味为4～6分，蜜味淡为1～3分。40分为总分，评分结果见表3。

2.3.2.3 综合评分 设定综合评分满分为100分，异阿魏酸含量、性状外观评分权重系数分别为60、40分。评分如下：性状外观评分以40分为最高分进行评分；综合评分=异阿魏酸含量/样品中异阿魏酸最高含量×60+性状外观评分。

2.3.3 正交试验结果 根据表3的正交试验结果可知，极差值的大小顺序为A＞B＞C，即各影响因素的主次顺序为加热温度、加热时间、闷润时间。A、B、C各水平的最大值分别为K2、K2、K3，最优组合方案为A2B2C3，即加热温度为100 ℃、加热时间为90 s、闷润时间为90 min。由表4的方差分析结果可知，加热温度对试验结果具有显著影响，加热时间、闷润时间对试验结果影响不显著。

表4 蜜升麻正交试验方差分析

2.3.4 验证试验 分别精密称取3份蜜升麻粉末，按“2.3.3”得出的最佳炮制工艺条件进行验证试验，测定异阿魏酸含量、性状外观评分及综合评分。结果显示异阿魏酸平均含量为0.26%，RSD为2.25%；性状外观平均评分为37分，RSD为3.09%；综合平均评分为96.56分，RSD为1.30%，表明蜜升麻炮制工艺稳定、可靠。（见表5）

表5 蜜升麻验证试验结果 （n=3）

3 讨论

酚酸类化合物异阿魏酸为升麻主要活性成分之一[14]。研究发现，蜜炙过程可使升麻中异阿魏酸含量升高[15]。张慧芳等[16]猜测可能是因为升麻中酚酸类化合物多以酸酯的形式存在，在炮制过程中其酸酯类成分水解生成有机酸和醇类，从而使异阿魏酸含量升高。但同时，张淑娟等[17]研究表明蜜炙升麻中异阿魏酸含量低于生品。2020年版《江苏省中药饮片炮制规范》[4]规定，升麻蜜炙后所含异阿魏酸（C10H10O4）含量不得少于0.20%，比2020年版《中华人民共和国药典》[18]中所规定生品升麻中异阿魏酸含量不得少于0.10%有所升高。升麻中异阿魏酸的含量经蜜炙后会改变，这对于升麻质量检测、药用价值和临床疗效都有很大影响[19-20]。正交试验结果显示，本研究最优炮制工艺条件下（加热温度100 ℃、加热时间90 s、闷润时间90min）制备的各组蜜升麻中异阿魏酸含量均符合2020年版《中华人民共和国药典》及《江苏省中药饮片炮制规范》规定。

蜜炙法是中药炮制传统方法之一，是将净选或切制后的药物加入一定量炼蜜拌炒的方法，为蜜制方法之一，传统的蜜炙方法有蜜浸法、蜜蒸法、蜜煎法、酥蜜法、蜜焙法、蜜炙法等[21-22]。目前还存在以下问题：（1）《中华人民共和国药典》及地方炮制规范中蜜炙工艺均没有具体参数，所用加热温度、加热时间及闷润时间均没有明确规定，炮制中一直沿用的“文火”“中火”“武火”均无量化指标，蜜炙药物火候难以掌握；（2）使用炼蜜大多没有按照规范的“嫩蜜”“中蜜”“老蜜”分级，只有笼统的生蜜、蜜液、蜜、炼蜜等规定，其炮制工艺和质量标准也各有不同；（3）稀释炼蜜所加开水量未有具体说明，容易造成久炒不干、产品含水量不达标、贮藏过程中发霉变质等现象；（4）各生产单位炮制水平不一、质量标准不统一等问题，导致市场上流通的饮片质量参差不齐，临床疗效受到严重影响。

本研究探索并优选出蜜升麻的最佳炮制工艺，以期为升麻蜜炙方法的研究、中药炮制规范化进程的推进及市场中药饮片质量标准的统一提供依据。