膜联蛋白A3在脓毒症中的表达变化及功能分析

马聪聪,陆红祥,马筱洁,史清海

1.新疆医科大学研究生院,乌鲁木齐 830054; 2.新疆军区总医院全军临床检验诊断中心,乌鲁木齐 830000; 3.新疆军区总医院创伤骨科,乌鲁木齐 830000; 4.新疆维吾尔自治区人民医院输血科,乌鲁木齐 830001

创伤是45岁以下人群的主要死亡原因。脓毒症是创伤后期相关死亡的主要原因,被定义为由宿主对感染的反应失调引起危及生命的器官功能障碍[1-2]。创伤后脓毒症增加了重症患者的病死风险,创伤后脓毒症的及时诊断和适当治疗对于改善创伤患者的住院结局至关重要[3-4]。因此,探寻可能影响创伤后脓毒症发生风险的关键分子及防治新靶标对提高严重创伤患者预后具有重要的临床意义。

目前C反应蛋白(C-reaction protein,CRP)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和降钙素原(procalcitonin,PCT)作为非特异性炎症标志物在脓毒症的早期诊断中被广泛应用,但其特异性一直饱受争议[5-6]。特别在创伤患者中,早期CRP和血浆IL-6水平升高对脓毒症的诊断意义不大。膜联蛋白A3(annexin A3,ANXA3)是膜联蛋白家族成员之一,属于Ca2+依赖性磷脂和膜结合蛋白[7-8]。研究表明,该家族参与多种生物学过程,在细胞发育及信号转导过程中具有重要作用[9]。ANXA3参与中性粒细胞的细胞内膜融合和颗粒聚集,在氧化应激、免疫炎症反应中发挥重要作用。Toufiq等[10]系统分析了6个数据集中ANXA3的表达变化,分析结果发现ANXA3在脓毒症患者中表达升高。同时,Yao等[11]发现ANXA3可鉴别脓毒症和非脓毒症患儿。但目前还没有研究报道ANXA3在创伤后脓毒症患者中的表达变化,同时ANXA3在创伤后脓毒症患者中发挥作用的功能机制尚未见报道。

资料与方法

1 数据集筛选

在本研究中,根据检索关键词:Sepsis,Trauma,Post-injury,从Gene Expression Omnibus (GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)下载创伤后脓毒症患者数据集,包括GSE28750[12]、GSE70311[2]及GSE12624。3个数据集的基本信息见表1。针对所有数据集进行归一化及log2化处理。从各个数据集中提取对应ANXA3 mRNA的表达数据用于后续分析。

表1 纳入研究数据集的基本信息

2 生物信息学分析

利用R语言的Limma软件包对GSE12624数据集中创伤后脓毒症ANXA3高表达组与ANXA3低表达组中差异表达基因进行鉴定。以倍数变化FC(fold change)>1.5和FDR(false discovery rate)<0.05为阈值判断差异表达基因的显著性。为分析差异基因的功能,对差异表达基因进行GO富集和KEGG通路分析。FDR<0.05被认为有统计学意义。以上分析均通过在线分析网站临床生信之家在线完成分析(https://www.aclbi.com/static/index.html#/)[13]。

3 统计学分析

结 果

1 ANXA3在创伤后脓毒症患者中表达升高

在GSE28750数据集中,共包含20例健康志愿者,11例术后非脓毒症患者及10例术后脓毒症患者,分析结果发现ANXA3 mRNA表达水平在脓毒症患者中较健康志愿者及非脓毒症患者显著上调(P<0.05,图1a)。在GSE70311数据集中包含10例严重创伤患者伤后0、1、2、3、5、7、14、21d的转录组数据,其中5例创伤后脓毒症患者及5例创伤后非脓毒症患者,分析结果发现脓毒症患者的ANXA3 mRNA动态变化趋势总体高于非脓毒症患者,其中以伤后第2、21天天最为显著(P均<0.05,图1b)。因此,笔者考虑ANXA3可能在创伤后脓毒症的发生发展中具有重要作用。

ANXA3:膜联蛋白A3

2 ANXA3对创伤后脓毒症患者的早期预警分析

为进一步探索ANXA3对创伤后脓毒症的早期预警作用,笔者将样本量最大的GSE12624数据集作为验证数据集。在GSE12624数据集中共包含36例创伤后非脓毒症患者及34例创伤后脓毒症患者,分析结果同样证实ANXA3 mRNA表达水平在创伤后脓毒症患者中显著上调(P<0.05,图1c)。同时,笔者将GSE12624数据集中的ANXA3用于创伤后脓毒症的早期预警,分析结果发现,ANXA3的AUC=0.766(0.650～0.859),在最佳截断值6.06,敏感性和特异性分别为76.47%和80.56%(图1d)。因此,ANXA3可用于脓毒症的早期预警。

3 ANXA3可能影响脓毒症中免疫炎症的表达变化

本研究在GSE12624的34例创伤后脓毒症患者中进一步分析了ANXA3与细胞因子、趋化因子和表面分子等免疫炎症相关分子的相关性,分析结果显示ANXA3与细胞因子(IL-10、IL1R1)、趋化因子(CCL19、CXCL13)、表面分子(CD163、CD55、CD58)等呈正相关(图2),提示ANXA3可能通过影响这些免疫炎症相关分子的表达,从而参与脓毒症的发生发展。

ANXA3:膜联蛋白A3

4 ANXA3在脓毒症中发挥作用的功能分析

为探寻ANXA3在脓毒症中发挥作用的功能,本研究在GSE12624的34例创伤后脓毒症中分析了ANXA3的可能作用。首先根据ANXA3的最佳截断值6.06,将34例创伤后脓毒症患者分为ANXA3高表达组与低表达组,然后比较两组间的差异基因。分析结果发现共有416个基因差异表达(FC>1.5且FDR<0.05),其中包括221个上调基因及195个下调基因(图3a、b),从图中可以看出,在ANXA3高表达组与低表达组的差异表达基因分析中,ARG1、CLECIB、PCOLCE2、CPNE5、DNAJC5、CD177、CD163、IL-10等基因表达上调,这些基因受ANXA3正向调控,促进表达;另外,CPA3、USP16、CLC、IFI44L、P2RY14、P2RY14、ETV7、SERPINB2等基因表达下调,ANXA3使这些基因受负面调控,抑制其表达。GO分析提示上调基因主要参与中性粒细胞脱颗粒,参与免疫反应的中性粒细胞活化和对氧化应激的反应等通路的富集较为显著(图4),这提示脓毒症期间以中性粒细胞为代表的固有免疫系统的改变;上调基因的KEGG分析发现主要参与细胞因子-细胞因子受体相互作用,河马信号通路和胰岛素信号传导途径等通路的富集最为显著(图5),这些结果表明,ANXA3通过影响免疫调节通路在脓毒症中发挥作用。下调基因的GO分析提示主要参与免疫反应激活信号转导,免疫应答激活细胞表面受体信号通路和抗原受体介导的途径等信号通路的富集较为显著(图6);而KEGG分析的下调基因主要显著富集在人类T细胞白血病病毒1的感染,PD-L1在肿瘤中的表达与PD-1检查点通路和T细胞受体信号传导途径等通路(图7);这提示脓毒症期间T细胞功能出现障碍、免疫功能受损。以上GO及KEGG分析均表明ANXA3可通过免疫调节信号通路而引起创伤性脓毒症。

ANXA3:膜联蛋白A3

图5 差异表达基因的京都基因与基因组数据库分析以及相关上调信号通路富集分析气泡图(横轴代表富集倍数,纵轴代表各通路名称,P值代表点的颜色,数量由点的大小表示,代表该通路中包含的基因与输入基因列表交集的基因数,泡泡的大小和色度显示了基因表达的比例和调整后的P值)

图6 差异表达基因的基因本体论分析以及相关下调信号通路富集分析气泡图(横轴代表富集倍数,纵轴代表各通路名称,P值代表点的颜色,数量由点的大小表示,代表该通路中包含的基因与输入基因列表交集的基因数,泡泡的大小和色度显示了基因表达的比例和调整后的P值)

图7 差异表达基因的京都基因与基因组数据库分析以及相关下调信号通路富集分析气泡图(横轴代表富集倍数,纵轴代表各通路名称,P值代表点的颜色,数量由点的大小表示,代表该通路中包含的基因与输入基因列表交集的基因数,泡泡的大小和色度显示了基因表达的比例和调整后的P值)

讨 论

在本研究中笔者使用生物信息学方法分析了ANXA3在创伤后脓毒症中的表达变化及功能。首先,在GEO中搜索与创伤后脓毒症相关的数据集,最终纳入3个数据集(GSE28750、GSE70311及GSE12624),分析结果均表明ANXA3在创伤后脓毒症患者中表达升高,ANXA3可能参与创伤后脓毒症的发生发展。进一步的功能分析发现,在创伤后脓毒症患者中ANXA3与细胞因子(IL10、IL1R1),趋化因子(CCL19、CXCL13),表面分子(CD163、CD55、CD58)等多种免疫基因表达相关。GO和KEGG富集分析均提示ANXA3在创伤后脓毒症中通过影响免疫调节通路发挥作用。因此,ANXA3可能是作为创伤后脓毒症早期预警的生物标志物及治疗新靶标。

目前,多项研究证实ANXA3可以激活多种信号通路,通过促进血管生成、血栓形成、诱导炎性反应、调节免疫,在感染、肿瘤、自身免疫性疾病中发挥重要作用[14]。目前已有研究表明ANXA3转录组水平在脓毒症患者中升高[10-11]。且有研究证实ANXA3蛋白在脓毒症小鼠不同组织和细胞上的表达情况;利用ANXA3基因敲除小鼠通过不同的实验模型,探索了ANXA3在脓毒症中的作用,结果表明ANXA3可作为脓毒症的生物标志物[15]。蒋万威和杨国辉[16]对脓毒症外周血及脓毒症心肌功能障碍差异基因进行GO和KEGG富集分析,得出ANXA3是脓毒症心肌功能障碍潜在的关键基因。在本研究中,笔者通过3个不同的创伤后脓毒症数据集发现并验证了ANXA3在创伤后脓毒症中表达上调,进一步表明了ANXA3在脓毒症的发生发展过程中发挥重要作用。既往研究表明ANXA3参与多种疾病的免疫炎症反应[14]。Zhu等[17]研究表明ANXA3通过诱导趋化因子CXCL8和CCL25释放,从而上调中性粒细胞-淋巴细胞比率。Meng等[18]研究证明当ANXA3下调时血清中IL-6、TNF水平明显降低。本研究中,笔者分析了ANXA3与细胞因子、趋化因子和表面分子等多种免疫应答分子的相关性,其中IL10、IL1R1、CCL19、CXCL13、CD163、CD55和CD58等与ANXA3表达呈正相关,进一步证实了ANXA3在创伤后脓毒症中参与调控免疫应答途径,从而在脓毒症发生发展中扮演重要角色。

为进一步探索ANXA3在创伤后脓毒症中发挥作用的功能,本研究比较了创伤后脓毒症患者中ANXA3高表达组与低表达组间的差异表达基因,共发现416个基因差异表达,并对其生物学功能和信号转导途径进行功能分析。GO和KEGG分析提示差异基因主要参与中性粒细胞脱颗粒现象、免疫反应的中性粒细胞活化和细胞因子-细胞因子受体的相互作用等通路。Perl等[19]研究发现ANXA3具有延长中性粒细胞寿命的作用,并与终末器官损伤有关。同时,目前的研究证实ANXA3介导钙依赖颗粒-噬菌体融合,从而增强中性粒细胞对微生物的杀灭活性。因此,本研究进一步证实ANXA3可能通过介导上述生物学进程参与脓毒症的发生发展。这些富集的信号通路也可能是创伤后脓毒症患者的诊疗评估中的关键因素,为脓毒症的治疗提供新思路。

本研究尚有不足之处。一是由于本研究获得的结果仅包含3个数据集,纳入研究的样本量有限,容易造成误差,可进一步增加GEO芯片数据或联合其他数据库进行分析;二是本研究基于生物信息学分析,未进行大规模的临床样本验证,需要更大的多中心前瞻性研究来进一步验证。今后课题组的相关工作将基于临床样本进行实验研究,以验证本研究结果的准确性,并进一步探索ANXA3参与创伤后脓毒症的作用机制。

综上所述,本研究发现ANXA3在创伤后脓毒症患者中表达上调,可能在创伤的早期阶段预测脓毒症的发生风险。同时,ANXA3在创伤后脓毒症中参与调节多条免疫炎症反应相关通路,为以ANXA3作为创伤后脓毒症发生发展的分子靶标研究提供新的思路。

作者贡献声明：马聪聪:论文起草及撰写;陆红祥:数据分析并制作图表、论文修改;马筱洁:数据收集整理;史清海:设计方案、论文修改及审校