微藻饵料添加光合细菌对安氏伪镖水蚤发育和繁殖的影响

潘 姚,李 峰,高梦晗,彭 珂,芮祥雨,李长玲,黄翔鹄

(广东海洋大学 水产学院,湛江 524025)

海水鱼类养殖业是中国水产养殖业的重要组成部分[1]。苗种培育是海水鱼类养殖的关键环节,在海水鱼类苗种培育过程中,营养全面的适口生物饵料是育苗成功的关键。目前市场上生物饵料主要以轮虫、卤虫(丰年虫)以及单细胞藻类等为主,这些饵料营养不足且成分不稳定,缺乏鱼类生长发育的必需脂肪酸。相比轮虫和卤虫,海洋桡足类在成长过程中需要经过11～12个阶段的变态,才能发育为成体,其大小通常在100～1 000 μm,可为水生动物幼体提供不同口径的开口饵料[2]。此外,桡足类富含EPA、DHA、游离氨基酸和一些其他必需微量营养素以及消化酶,更有利于鱼类幼体生长发育。研究表明,海洋桡足类是人工育苗鱼虾的理想活饵料,投喂桡足类培苗的成活率可高达85%以上[3]。然而,桡足类人工繁殖速率低,目前仍未能实现大规模培养[4],市场一直处于供不应求状态。

在实际培养过程中,单胞微藻具有营养丰富、生长繁殖迅速和易培养等特点,常作为桡足类饵料[5]。由于细胞大小和营养成分存在较大差异,喂食不同的单胞微藻会显著影响桡足类的生长和繁殖[6-7]。因此,筛选合适的饵料微藻对提高桡足类的生长和繁殖至关重要。除了饵料微藻,光合细菌也在动物性生物饵料培养方面发挥着重要作用[8-9]。光合细菌含有丰富的蛋白质、B族维生素、促生长因子、辅酶Q、抗病毒因子和色素等生理活性物质,是一种营养丰富的饲料添加剂[10]。以一定浓度光合细菌与单胞藻混合投喂,可以显著提高轮虫的产量[8,11]。但目前,关于光合细菌作为饵料添加剂对桡足类发育、生殖的影响的报道甚少。本文以安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomusannandalei)为试验对象,首先研究不同微藻饵料对安氏伪镖水蚤生长和生殖的影响,然后以光合细菌作为饵料添加剂,比较分析在饵料微藻中添加光合细菌对安氏伪镖水蚤发育和繁殖的影响,研究结果将为建立桡足类规模化养殖用饵料体系提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 安氏伪镖水蚤的采集与培养

安氏伪镖水蚤用13 #浮游生物网采集自湛江废弃池塘(20°56′10.48″N,110°31′46.46″E)[12],实验室镜检,在解剖镜下挑出行动能力强的带卵安氏伪镖水蚤,置于灭菌后的海水中培养,培养饵料为湛江等鞭金藻。培养条件:温度28 ℃,盐度27,光照1 200 lx,连续培养多代后取其子代作为实验对象[13]。

1.2 微藻培养

实验用微藻共4种,分别为湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、威氏海链藻(Conticribraweissflogii)、小球藻(Chlorellavulgaris)。藻种由广东海洋大学藻类资源与养殖环境修护团队提供。培养基为海 f/2培养基培养,培养温度为室温25 ℃,光照3 000 lx,24 h全光照,使用过滤空气通气培养。培养至指数生长期进行实验。

1.3 实验设计

1.3.1 微藻饵料对安氏伪镖水蚤发育和繁殖的影响

(1)发育实验。在解剖镜下挑选出健康活泼刚孵出的NⅡ期无节幼体10只,放入15 mL试管中每根试管中加入新鲜海水10 mL,并标记[14]。培养条件:温度28 ℃,盐度27,光照1 200 lx。每日投喂新鲜的饵料微藻,使水体中饵料浓度为1 mgC/L(按含碳量计),每日投喂1次,投喂前完全换水。实验设置4个实验组,分别投喂湛江等鞭金藻、牟氏角毛藻、威氏海链藻以及小球藻,每个实验组设置A和B两组,A组用于无节幼体发育的观察,B组用于桡足幼体发育的观察,每组3个平行。开始时,每6 h观察幼体发育情况,等幼体发育到NⅤ期无节幼体和CⅣ桡足幼体时,改为每2 h观察一次。每次随机抽取3～4个幼体进行观察,观察完立即把幼体放回原试管中,分别记录无节幼体和桡足幼体的发育时间和存活率。

(2)繁殖实验。在解剖镜下挑选成熟雄性和挂卵的雌性安氏伪镖水蚤各1只放入15 mL试管中,每根试管中加入新鲜海水10 mL[15]。实验设置4个实验组,分别投喂湛江等鞭金藻、牟氏角毛藻、威氏海链藻以及小球藻,每个实验组设3个平行,每日投喂一次,饵料微藻的浓度(按含碳量计)控制为1.0 mgC/L。每日观察安氏伪镖水蚤的产幼情况,发现产幼及时对其进行计数,并挑出亲体置于新鲜的藻液中继续培养。实验连续进行10 d,记录产幼次数和产幼数量。

1.3.2 饵料微藻添加光合细菌对安氏伪镖水蚤发育和繁殖的影响

(1)发育实验。在解剖镜下挑选健康活泼刚孵出的NⅡ期无节幼体10只,放入15 mL试管中,每根试管中加入新鲜海水10 mL,并标记。微藻饵料为1.3.1节实验中效果最佳的藻类。光合细菌购自广东绿百多生物开发有限公司,其活菌数量>0.5×108cfu/mL。实验共设置5个实验组,每组每次除了使水体中微藻浓度为1 mgC/L外,还分别投喂不同比例光合细菌。光合细菌的投喂方法:将光合细菌用8 000 r/min的速度离心后加蒸馏水稀释后投喂桡足,使水体中光合细菌浓度分别为0、0.25、0.5、1以及2 mgC/L。每个实验组设置A和B两组,A组用于无节幼体发育的观察,B组用于桡足幼体发育的观察,每组3个平行。培养条件和观察方法同1.3.1。

(2)繁殖实验。在解剖镜下挑选成熟雄性和挂卵的雌性安氏伪镖水蚤各1只放入15 mL试管中,每根试管中加入新鲜海水10 mL。实验共设置5个实验组,每组除使水体中微藻为1 mgC/L外,还分别投喂不同比例的光合细菌,投喂方法同1.3.2节中的发育实验。每组设置3个平行。每天观察安氏伪镖水蚤的产幼情况,发现产幼及时对其进行计数,并挑出亲体置于新鲜的藻液中继续培养。实验连续进行10 d,记录产幼次数和产幼数量。

1.4 含碳量的测定

藻液和菌液的含碳量用德国耶拿Multi N/C 2100型总有机碳分析仪检测。

1.5 发育时间的确定

发育时间通过计算半数发育时间来确认[16]。

1.6 存活率的确定

存活率(Survival rate,SR)按公式计算:

SR =n/10×100%

式中n代表存活的幼体数。

1.7 数据统计分析

实验数据用Microsoft Excel做初步处理,采用SPSS软件,对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVE)。

2 结果与分析

2.1 不同微藻饵料对安氏伪镖水蚤发育和生殖的影响

不同微藻饵料对安氏伪镖水蚤的发育时间有显著影响(P<0.05)。在无节幼体到桡足幼体期,如图1(a)所示,饲喂湛江等鞭金藻的安氏伪镖水蚤,其无节幼体到桡足幼体发育时间最短,为70 h。其次是角毛藻组,其发育时间为74 h。然后是海链藻组,其发育时间为84 h。饲喂小球藻的安氏伪镖水蚤无节幼体到桡足幼体的发育时间最长,需要93 h。从整个发育阶段看,饲喂湛江等鞭金藻的幼体的发育时间同样最短,为193 h。其次是角毛藻组和海链藻组,其发育时间分别为212 h和239 h。饲喂小球藻的安氏伪镖水蚤,其幼体发育到成体的时间在4组中最长,需要258 h。

(a)喂食不同微藻饵料安氏伪镖水蚤幼体在发育时间上的差异;(b)喂食不同微藻饵料安氏伪镖水蚤幼体在存活率上的差异。不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

从个体存活率数据来看,如图1(b)所示,在无节幼体到桡足幼体阶段,饲喂湛江等鞭金藻的安氏伪镖水蚤幼体的存活率最高,为90%,其次是角毛藻组和海链藻组,其幼体存活率分别为83%和80%。饲喂小球藻的安氏伪镖水蚤的幼体存活率最低,为67%。从整个发育阶段来看,饲喂湛江等鞭金藻的安氏伪镖水蚤,其幼体存活率显著高于其他3组,达到60%。饲喂海链藻、角毛藻和小球藻的安氏伪镖水蚤,其桡足幼体的存活率均低于50%,分别为47%、43%和40%。以上结果表明,饲喂湛江等鞭金藻有利于安氏伪镖水蚤无节幼体到桡足幼体和桡足幼体到成体的生长、存活。

饲喂不同微藻饵料安氏伪镖水蚤,在总产幼体数、每次产卵量和生殖次数方面存在明显差异。由表1可知,在10 d的实验周期内,喂食湛江等鞭金藻安氏伪镖水蚤总产幼体数最多,达到(54.33±14.66)个。其次是角毛藻组和海链藻组,总产幼体数分别达到(50.66±7.40)个和(50.33±7.41)个。喂食小球藻的安氏伪镖水蚤的总产幼体数最少,为(47.33±15.20)个。在生殖次数和生殖量方面,喂食海链藻的安氏伪镖水蚤的生殖次数最多,达到(4.3±1.2)次/10 d,每次产卵量为(11.62±4.57)个,在所有组中最低。湛江等鞭金藻组生殖次数为(3.3±0.9)次/10 d,每次产卵量达到(16.30±3.63)个,在所有组中最高。在角毛藻组中,安氏伪镖水蚤的生殖次数达到(3.3±0.5)次/10 d,每次产卵量为(13.82±3.61)个。饲喂小球藻的安氏伪镖水蚤的生殖次数最低,为(3.0±0.8)次/10 d,但每次产卵量达到(15.78±4.29)个,仅次于湛江等鞭金藻组。

表1 饲喂不同微藻饵料安氏伪镖水蚤在总产幼体数、每次产卵量和生殖次数上的差异

2.2 微藻饵料中添加光合细菌对安氏伪镖水蚤发育和生殖的影响

根据第1个实验结果,选取湛江等鞭金藻作为安氏伪镖水蚤的饵料微藻,通过添加不同比例光合细菌,探究微藻饵料添加光合细菌对安氏伪镖水蚤发育和繁殖的影响。从图2(a)可以观察到,光合细菌的添加对安氏伪镖水蚤幼体发育时间有显著影响(P<0.05),在无节幼体到桡足幼体发育阶段,在投喂等量微藻饵料的条件下,添加的光合细菌可以缩短幼体的发育时间。其中,当添加光合细菌浓度达到1 mgC/L时,无节幼体所需时间最短,为(56±0)h,与对照组相比,发育时间缩短了20%。当添加光合细菌浓度为0.25、0.5和2 mgC/L时,幼体发育时间均比对照组有小幅度缩短,分别为(67.33±0.47)、(67.33±0.47)和(66±0)h。在整个发育阶段,投喂等量微藻饵料的条件下,添加光合细菌可以显著影响幼体的发育时间。光合细菌浓度为0.25 mgC/L和0.5 mgC/L的两个实验组幼体发育时间分别达到(184±3.30)h和(183±4.24)h,与对照组相比均有小幅度缩短。当添加光合细菌浓度为1 mgC/L时,幼体发育到成体所需的时间最短,为(165±3.56)h,与对照组(0 mgC/L)相比,发育时间缩短了约14.5%。当添加光合细菌浓度为2 mgC/L时,幼体发育到成体所需的时间最长,为(210±0)h。

在个体存活率方面,如图2(b)所示,除1 mgC/L实验组达到了对照组的水平(90%)以外,其余实验组的存活率均显著低于对照组。当光合细菌浓度为0.5 mgC/L时,无节幼体存活率最低,为63%±4.71%。在整个发育阶段,添加光合细菌浓度为0.5 mgC/L和1 mgC/L的两组桡足幼体存活率分别达到67%±4.16%和73%±1.57%,与对照组相比,分别提高了约12%和22%。而光合细菌浓度为0.25 mgC/L和2 mgC/L的两个实验组桡足幼体存活率显著低于对照组,其中,当添加光合细菌浓度为2 mgC/L时,桡足幼体的存活率最低,为47%±3.14%。

在投喂等量微藻饵料的条件下,添加不同浓度光合细菌对安氏伪镖水蚤的总产幼体数、每次产卵量和生殖次数方面有显著影响。由表2可知,在10 d的实验周期内,添加光合细菌浓度1 mgC/L组,其安氏伪镖水蚤的总体产幼数达到(65.0±10.03)个,比对照组增产约20%。其次是光合细菌浓度为0和0.25 mg/L时,总产幼体数分别为(54.33±14.66)个和(54.67±15.0)个。当添加光合细菌浓度达到2 mgC/L时,安氏伪镖水蚤的总产幼体数最少,为(45.0±7.48)个,比对照组少约17%。在生殖次数方面,添加光合细菌浓度为1 mgC/L的实验组生殖次数最多,达到(3.47±0.47)次/10 d,略高于对照组。其他3组的生殖次数均低于对照组。在生殖量方面,添加光合细菌浓度为0.5 mgC/L的实验组每次产卵量最高,与对照组相比,每次多产约14.5%。其次是0.25 mgC/L实验组,其每次产卵量达到(18.22±1.75)个。而光合细菌浓度为1 mgC/L的实验组每次产卵量为(17.73±4.61)个,与对照组相比,每次多产约9%。当光合细菌浓度为2 mgC/L时,其每次产卵量在所有组中最低,为(13.50±2.54)个,每次比对照组减产约17%。

3 讨论

桡足类规模化养殖离不开优质饵料的供应,合适的饵料供应是决定桡足类生长、繁殖和自身生理状态的关键因素[17]。微藻饵料具有生长速度快、繁殖周期短、营养丰富、易培养等诸多优点,是桡足类规模化养殖最有潜力的饵料来源。然而,微藻饵料的种类、营养、大小等直接影响桡足类的生殖、发育及存活[18-20]。因此,筛选合适的微藻饵料是桡足类培养的一项重要工作。Cahoon[21]研究表明饲喂不同微藻的桡足类,在生殖力、发育率和存活率方面呈现显著差异,他认为这种差异与微藻饵料体内营养成分及其含量的不同密切相关。Jonasdottir[20]也观察到,微藻饵料中DHA与EPA的比率越高,其喂养的桡足类产卵量也越高。有研究显示[22],微藻饮食中DHA含量越高,其桡足类的种群数越大。本研究中的4种微藻饵料体内DHA和EPA含量差异很大。湛江等鞭金藻富含DHA,其含量可达总脂的15.75%,DHA与EPA比高达10.5∶1[23]。海链藻和角毛藻则富含EPA[24],其DHA与EPA比分别约为1∶5.8和1∶4.96。小球藻则被报道含有极少或不含有DHA和EPA[23]。根据结果,喂食湛江等鞭金藻的安氏伪镖水蚤具有最短的发育时间、最高的存活率和产卵量,这也可能与湛江等鞭金藻含有高DHA与EPA比例有关。

光合细菌是在自然界普遍存在,具有原始光能合成体系的原核生物,含蛋白质、维生素和矿物质等营养物质,常应用于水质净化[9]和饲料添加剂中[25]。有报道显示,光合细菌所含的生物素为具有生理活性的D-异构体,可明显促进养殖生物的生长发育,缩短养殖周期[26]。本研究中以湛江等鞭金藻为饵料时,无论是在安氏伪镖水蚤无节幼体发育阶段,还是桡足幼体发育阶段,当添加光合细菌的含碳量与湛江等鞭金藻的含碳量之比达到1∶1时,安氏伪镖水蚤幼体发育时间最短,存活率最高,产幼数也达到最大,表明在微藻饵料中添加一定量的光合细菌可以促进安氏伪镖水蚤的发育和繁殖。这可能与光合细菌调节水质、降低氨氮、稳定pH等功能有关。光合细菌在饵料和调节水质方面起到一定作用,在长期喂养过程中发现,桡足类无节幼体肠道有较多光合细菌,此阶段主要是起到滤食的作用。随着个体长大,在桡足幼体至成体阶段,肠道中细菌很少,主要是藻类,此时主要是调节水质的作用。此外,当光合细菌的含碳量与湛江等鞭金藻的含碳量之比达到2∶1时,会在一定程度上抑制安氏伪镖水蚤的发育和繁殖。这种抑制作用可能是过多光合细菌引起水质变化和生物之间的竞争等因素所导致。

4 结论

本文以安氏伪镖水蚤为对象,首先研究不同微藻饵料对安氏伪镖水蚤发育和繁殖的影响,筛选并确定湛江等鞭金藻为安氏伪镖水蚤的最适微藻饵料。然后在饲喂等量的湛江等鞭金藻饵料的基础上,开展添加不同浓度的光合细菌对安氏伪镖水蚤发育和繁殖的影响研究。结果显示:当添加的光合细菌浓度达到1 mgC/L时,安氏伪镖水蚤无节幼体和桡足幼体的发育时间分别缩短了20%和14.5%,个体存活率提高了21.7%,总产幼体提高了20.4%。故藻菌比例1∶1作为安氏伪镖水蚤的饵料效果最佳。当添加光合细菌浓度为2 mgC/L时,会显著抑制安氏伪镖水蚤幼体的发育和繁殖。然而,我们目前对光合细菌影响桡足类发育和繁殖的机制还不清楚,还需要进一步研究。