不同鸭品种脂肪型脂肪酸结合蛋白基因部分序列多态性差异研究

董飚，王健，，孙国波，，纪荣超，张干生，

(1. 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2. 国家级水禽基因库，江苏 泰州 225300)

近年来，国家把种源安全提升到关系国家安全的战略高度，要求行业集中力量突破瓶颈，补短板，强化优势，实现种源自主可控。我国鸭养殖量约占全球的74.2%，带动了羽绒、食品、餐饮等行业发展，对我国畜牧业发展具有重要的作用。《国家畜禽遗传资源品种名录(2021年版)》中收录了我国地方鸭品种37个，培育配套系10个。随着人们生活水平的提升，生活习惯的改变，目前拥有的鸭种源尚不能满足市场需求。为解决鸭产业种源制约问题，需要加强开展鸭种质资源的收集、鉴定与评价工作，进而根据市场需求开展种源创制工作。

脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid bingding protein，A-FABP)是脂肪酸结合蛋白家族成员之一，主要在脂肪细胞中表达[1]。A-FABP是甘油三酯的贮存库，在甘油三酯的形成以及脂溶解的过程中A-FABP储存或释放出大量的脂肪酸，从而参与调控生成及溶解的生化循环[2-3]。因此，A-FABP基因常常作为候选基因用于探讨其与畜禽动物脂肪沉积相关的研究。赵旭庭等[4]发现A-FABP基因单核苷酸多态性(SNP)对樱桃谷鸭腹脂重、腹脂率、皮脂率和腿肌脂肪含量有显著性影响。张海波等[5]发现A-FABP基因内含子1序列中2个单核苷酸突变与番鸭胸肌率、肌肉pH值以及胸肌肌内脂肪含量有显著相关性。秦豪荣等[6]也在A-FABP基因内含子1中发现了另外1个单核苷酸突变，其可影响番鸭脂肪沉积能力和胸肌肌苷酸含量。杨军等[7]在荆江麻鸭A-FABP基因内含子2中发现了3种基因型，AA型和BB型的活重、腿肌率、瘦肉率以及皮脂率存在显著性差异。董飚等[8]发现A-FABP基因内含子2的A-C突变对番鸭腹脂重和腹脂率均有显著性影响，同时还与公鸭的体重和部分屠宰性能指标有关联。

鸭A-FABP基因多态性的研究集中在少数鸭品种上，而我国拥有丰富的地方鸭品种。鉴于此，本试验以巢湖鸭、广西小麻鸭、高邮鸭等9个地方鸭品种为素材，采用PCR-SSCP方法检测鸭A-FABP基因部分序列多态性，统计不同品种的基因型和等位基因频率，分析品种之间的差异和群体遗传参数，为我国地方鸭品种保护和开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试鸭群及基因组

试验动物为国家级水禽基因库(江苏)内保存的巢湖鸭、广西小麻鸭、高邮鸭、金定鸭、荆江麻鸭、靖西大麻鸭、临武鸭、山麻鸭和攸县麻鸭，每个品种随机挑选60只进行翅静脉采血2 mL，公母比例为1∶1，血液采用肝素钠抗凝。血液离心留取红细胞，根据血液基因组DNA提取试剂盒的操作步骤完成每个样品的DNA提取工作，并测定其质量和浓度，样品DNA浓度调整为50～100 ng/μL，置于-20 ℃冷冻保存备用。

1.2 引物设计

根据GenBank中鸭A-FABP基因序列设计了1对引物，序列为F：5′-TCTTCAGTCCATAGCACCCC-3′，R：5′-AAAAGGAACTCACCACCACC-3′，可扩展A-FABP基因的部分内含子2序列和完整的外显子3序列，扩展长度为171 bp，由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.3 PCR扩增程序

PCR反应体系:10×PCR buffer(含 Mg2+)2.5 μL,10 mmol/L dNTPs 2 μL，10 pmol/L上下游引物各1 μL，5 U/μLrTaq酶0.16 μL，50～100 ng/μL DNA模板1 μL，用灭菌双蒸水补至25 μL。

PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，温度降至室温即完成。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，符合要求后再进行SSCP检测。

1.4 SSCP分析及DNA测序

5 μL PCR 产物和4 μL加样缓冲液混匀(主要成分为去离子甲酰胺)，98 ℃加热变性10 min，然后冰水浴5 min。经过前处理的PCR产物用12%聚丙烯酰胺凝胶在电压150 V条件下电泳12～14 h，银染显条带后判别各个样品的基因型。

根据PCR-SSCP的结果，每种基因型随机选择代表个体2～3个进行PCR产物纯化回收，并送上海桑尼生物科技有限公司测序。

1.5 数据处理

测序结果用软件DNAMAN进行分析查找不同基因型间单核苷酸突变情况。运用Excel编辑公式计算基因型频率、等位基因频率、纯合度、杂合度和多态信息含量等遗传参数，用卡方检验(χ2)各品种群体是否处于哈代温伯格平衡以及基因型频率在各品种间差异程度。

2 结果与分析

2.1 PCR-SSCP检测

利用引物对每只鸭DNA进行 PCR-SSCP检测，共检测到4个等位基因，8种基因型，分别定义为CC、CD、CE、CF、DD、DE、DF、EE型，部分基因型结果见图1。

图1 部分样品A-FABP基因PCR-SSCP检测

2.2 多态性基因片段的克隆和测序

将测序结果进行比对发现不同基因型间共出现了6个位点变化，其中DD型序列与GenBank中鸭A-FABP基因(HQ640428.1)序列一致，其他基因型序列与DD型序列相比出现了突变位点，分别为1 692位点的C→A突变，第1 705、1 706位点的缺失，1 708位点的T→C突变，1 787位点的T→C突变，1 814位点的G→A突变(图2)。1 692、1 705、1 706、1 708 位点处于内含子2中，1 787、1 814位点处于第3外显子中，外显子中的突变为同义突变。

图2 不同基因型间核苷酸序列比对

2.3 不同基因型(等位基因)频率在不同品种鸭中的分布

每个个体确定基因型后，对每个品种的基因型频率和等位基因频率进行统计。由表1可知，大致分为3类，其中靖西大麻鸭以DD、DE基因型为主，巢湖鸭、高邮鸭和荆江麻鸭以CD、DD基因型为主，广西小麻鸭、金定鸭、临武鸭、山麻鸭、攸县麻鸭以DD基因型为主。9个鸭品种均以D等位基因频率最高，均在0.5以上；靖西大麻鸭以E等位基因频率次之，而其他8个鸭品种以C等位基因频率次之。

表1 不同鸭品种基因型频率及等位基因频率结果

不同基因型在鸭品种间分布χ2检验结果见表2。靖西大麻鸭A-FABP的基因型分布与巢湖鸭、临武鸭存在显著差异(P<0.05)，与其他6个鸭品种存在极显著差异(P<0.01)。其他鸭品种间基因型分布无显著性差异。

表2 不同鸭品种间基因型分布χ2检验

2.4 群体遗传信息分析和哈代温伯格平衡检验

群体遗传参数分析和哈代温伯格平衡χ2检验见表3。广西小麻鸭、金定鸭、临武鸭、山麻鸭、攸县麻鸭 5个世代群体的纯合度都超过了0.5以上，表现为较高的纯合度；巢湖鸭、高邮鸭、荆江麻鸭和靖西大麻鸭的纯合度在0.4～0.5之间。巢湖鸭的多态信息含量高于0.5，为高度多态；其他8个鸭品种的多态信息含量在0.25～0.5之间，为中度多态。攸县麻鸭偏离了哈代温伯格平衡状态，其他8个鸭品种均处于哈代温伯格平衡状态。

表3 不同鸭群体遗传参数和哈代温伯格平衡检验

3 讨论

SNP标记是目前使用比较多的分子标记之一，在育种中可实现早期选择，节省大量的人力和物力，已被广泛应用于动植物分子标记辅助育种实践。SNP检测的方法包括了全基因组测序、DNA芯片、酶切和PCR-SSCP等。本试验采用PCR-SSCP方法在9个地方鸭品种A-FABP基因部分内含子2和外显子3序列上发现了6个变化，分别为C1692A、T1708C、T1787C、G1814A点突变和第1 705、1 706位点的缺失，T1787C、G1814A的变化没有引起氨基酸序列变化。这与团队之前在番鸭上的研究结果存在较大差异，番鸭群体内含子2中存在1个A-C点突变，与GenBank中的序列(HQ640428.1)相比在内含子2上还存在其他2个点突变[8]。这是因为番鸭属于栖鸭属，原产于南美洲和中美洲的热带地区，其瘦肉率高，肉质鲜香，而本试验所用的9个鸭品种均为河鸭属，是我国地方鸭品种，它们在进化上存在较大差异，生活习性、生长速度和生产性能也存在较大差别[9-10]。

9个鸭品种均以D等位基因频率最高，E为靖西大麻鸭的第二高频率等位基因，而其他8个鸭品种的第二高频率等位基因为C，这是不同鸭在品种形成过程中受到了自然和人为选择的结果。χ2检验显示靖西大麻鸭的基因型分布与巢湖鸭、临武鸭存在显著性差异，与其他品种存在极显著差异，其他鸭品种之间基因型分布无显著性差异。董飚等[11]在A-FABP基因内含子1中发现了多个突变位点，对同样的群体进行了分析发现，靖西大麻鸭的基因型分布与其他鸭群体之间的差异情况与本试验的研究结果一致，但是部分其他群体之间也存在显著性或极显著性差异。不同鸭品种在A-FABP基因上形成了特有的基因型频率，这可能与鸭品种的脂肪沉积形成有关，但是机理尚不明确。在鸭品种保护工作中需要对不同的群体加强保护。本试验结果显示靖西大麻鸭在A-FABP基因多态性具有其独特性，具有较高的保护和作为育种材料的价值。

不同的鸭品种在品种形成过程中受到自然选择、人工长期的选种和选配作用下，逐渐形成了各具特色的群体特征特性。品种在某些基因座上逐渐趋于纯合的程度往往与选择压力大小有关，如果选择压较小，基因座会表现出更为丰富的多态性。杂合度和多态信息含量分析是衡量群体基因多态性和群体变异程度的方法之一。本试验中巢湖鸭、高邮鸭、荆江麻鸭和靖西大麻鸭的杂合度在0.5以上，广西小麻鸭、金定鸭、临武鸭、山麻鸭、攸县麻鸭 5个群体的杂合度在0.5以下。巢湖鸭的多态信息含量高于0.5，为高度多态；其他8个鸭品种的多态信息含量在0.25～0.5之间，为中度多态。杂合度和多态信息含量的结果说明这9个鸭品种在A-FABP基因位点具有较高的多态信息含量，品种内遗传变异大，持有较多的遗传信息，符合品种保护的要求。在育种中，如果考虑脂肪沉积和肉质方面可根据这些品种的基因型频率和等位基因频率分布情况选择有明显区别的群体作为育种材料，可获得较为广泛的遗传基础。攸县麻鸭偏离了哈代温伯格平衡状态，可能是该群体保存数量不足引起了基因漂泊，需要适当提高群体规模以达到保种要求。这与之前同样的群体不同位点的研究结果不同，在A-FABP基因内含子1中发现的突变结果分析发现山麻鸭和临武鸭偏离了哈达温伯格平衡[11]。

本试验发现，我国9个地方鸭品种在A-FABP基因部分内含子2和外显子3序列中存在6个点突变，2个点突变位于外显子3中，为同义突变。从等位基因频率、基因型频率和χ2检验发现，靖西大麻鸭和其他8个鸭品种存在显著差别。群体遗传参数结果表明A-FABP基因在不同鸭品种中具有较丰富的多态性。