原花青素下调miR-181a抑制颗粒细胞氧化损伤的作用机制

卢清侠，王献伟，马强，陈俊峰，高彬文，邢宝松，张家庆*，任巧玲*

(1. 河南省农业科学院畜牧兽医研究所/河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002；2. 河南省畜牧技术推广总站，河南 郑州 450008)

在哺乳动物和人类，70.0%～99.9%的卵泡在发育的不同阶段发生闭锁[1]。研究表明，颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因，并先后在多种动物中得到证实[2-3]。体内外各种刺激可诱发卵泡微环境产生活性氧簇物质(reactive oxygen species，ROS)。低浓度的ROS是重要的第二信使，可调控基因的表达；而高浓度的 ROS可导致重要细胞器和DNA的不可逆损伤，最终导致细胞凋亡[4]。大量研究表明，氧化应激诱导剂，如3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid，3-NP)、化疗药物、多环芳香烃等能够有效诱导有腔卵泡闭锁[5-6]，而在卵泡闭锁前可首先检测到ROS水平的显著上升，并且这些因素诱导的凋亡均能为抗氧化剂所抑制[7]。葡萄籽提取物原花青素(grape seed procyanidins，GSP)是从葡萄籽中提取的一种机体内不能合成的新型高效天然抗氧化剂物质[8]。在人和动物研究发现，补充GSP能有效抑制卵巢氧化损伤，从而提高了颗粒细胞活性，但GSP保护颗粒细胞氧化损伤的作用机制尚不明确[9-10]。

微RNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动物中参与转录后基因表达调控[11]。miRNA可通过调节线粒体代谢来影响细胞ROS水平[12]，也可通过调控细胞增殖和分化的关键因子[13]。miRNA表达异常也与多种生殖性疾病密切相关，如多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)等[14]。miR-181a是miR-181家族成员之一，已被证实是一种应激性miRNA[2，15]，可通过对相关基因的调节发挥抗氧化作用，如miR-181a可以间接调控叉头框蛋白O1(forkhead box protein O1，FoxO1)基因表达来减轻小鼠颗粒细胞氧化损伤[2]。近年来的研究发现，miRNA是GSP的新靶标，GSP可调节肝、肾脏等相关疾病中致病性miRNA的表达[16]。卵泡的异常闭锁与氧化应激密切相关，探讨GSP是否可以通过对miRNA的调节来发挥抗氧化作用，具有理论和实际意义。本研究从体内和体外水平探究GSP对氧化应激诱导颗粒细胞损伤的作用及miR-181a表达的影响，以期揭示其作用机制，为新药物研发和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

3周龄KM雌性小鼠购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场；GSP购自天津尖峰天然产物研究开发有限公司；原花青素 B2(GSPB2)、荧光素酶报告载体、荧光素酶活性检测试剂盒购自美国 Sigma 公司；DMEM/F-12培养基、胎牛血清购自美国 GIBCO 公司；H2O2(30%，AR 级)购自上海国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液购自北京索莱宝科技有限公司；miR-181a模拟物(miR-181a mimics)、mimic阴性对照(mimics NC)、miR-181a 抑制剂(miR-181a inhibitor)、inhibitor阴性对照(inhibitor NC)由上海吉玛制药技术有限公司合成；miR-181a、U6引物序列由天根生化科技(北京)有限公司设计合成；miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；活化的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3，#9661)购自Cell Signaling Technology公司；TGF-β受体Ⅰ(TGFBR1，ab31013)购自Abcam公司；GAPDH(10494-1-AP)购自武汉三鹰生物技术有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性检测试剂盒、四甲基偶氮唑盐 (methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；孕马血清促性腺激素(PMSG)购自宁波第二激素厂。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组与处理

所有动物适应1周环境后随机分成3组：对照(Control)组、3-NP组、GSP+3-NP组，每组10只。Control组小鼠每日8：00和20：00腹腔内注射0.1 mL生理盐水，连续7 d；3-NP组小鼠每日同时间腹腔注射0.1 mL的3-NP(25 mg/kg)[6]，连续7 d；GSP+3-NP组提前1周饲喂含有GSP的饲料(在小鼠的基础日粮中按照200 mg/kg比例添加GSP制成)，饲喂至试验结束，试验开始后每日同时间腹腔注射0.1 mL的3-NP，连续7 d。GSP的剂量和处理时间参照文献[17]。试验结束后，所有动物颈部脱臼处死，采集相应小鼠卵巢和卵泡颗粒细胞。

1.2.2 免疫组化分析

首先将收集的不同组别的小鼠卵巢用4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、蜡块连续切片、常规脱蜡至水；高压进行抗原修复15 min，PBS洗3次，每次5 min，进行抗原修复；用3% H2O2室温孵育15 min，PBS清洗 3次，每次5 min，以阻断内源性过氧化物酶；用吸水纸擦干载玻片，滴加正常山羊血清室温封闭15 min；滴加cleaved caspase-3抗体，4 ℃过夜，PBS 洗 3 次后加入生物素标记的二抗，室温孵育30 min，PBS清洗 3次，每次5 min，滴加新鲜配制的3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色液，室温孵育3～5 min，光学显微镜下观察染色结果。

1.2.3 细胞分离与培养

3周龄KM雌性小鼠每只腹腔内注射10 U的PMSG，48 h后颈椎脱臼处死，在无菌条件下使用眼科镊子和剪刀迅速取出双侧卵巢，用预热的PBS(37 ℃)清洗3次，在体视显微镜下使用1 mL注射器针头去除其周围脂肪和被膜，再用新的1 mL注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入预热(37 ℃)平衡好的培养基 (DMEM/F12培养基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素+10% FBS)重悬，调整细胞密度后接种于培养皿中，于37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养。

1.2.4 细胞转染

将分离后重悬的小鼠颗粒细胞接种于12孔板或96孔板中，分为5组：对照(Control)组，进行正常培养；miR-181a mimics转染组，加入 miR-181a mimic；mimics NC组，加入mimic NC；miR-181a inhibitor转染组，加入miR-181a inhibitor；inhibitor NC组，加入inhibitor NC。参照 Lipofectamine 3000 说明书进行转染，当细胞生长密度为70%～80%时，弃去孔中的培养基，加入相对应的转染试剂。转染48 h后，部分颗粒细胞用于检测miR-181a和TGFBR1表达水平，部分细胞用于细胞活力检测。上述序列均由上海吉玛公司合成，其序列分别为miR-181a mimics：5′-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3′，5′-UCACCGACAGCGUUGAAUGUUUU-3′；mimic NC：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；miR-181a inhibitor：5′-ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU-3′；inhibitor NC：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.2.5 双荧光素酶活性检测

根据TargetScan和miRanda 数据库预测显示，miR-181a与TGFBR1存在靶向关系，TGFBR1是 miR-181a 的靶基因，二者存在结合序列区域，分别构建野生型(wild type，WT)TGFBR1-3′UTR-WT和突变型(mutant type，MUT)TGFBR1-3′UTR-MUT质粒，取人胚胎肾上皮细胞系(HEK 293T)细胞种入24 孔板中，取构建质粒与miR-181a mimics、miR-181a NC共转染 HEK 293T 细胞48 h，按照说明书要求制备颗粒细胞提取物，测定各组荧光素酶活性。

1.2.6 GSPB2干预处理

用0.25%胰蛋白酶消化单层培养的颗粒细胞，用含血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔2 500个细胞接种于96孔培养板中，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底。具体分组为：对照(Control)组，添加新的DMEM/F12+5% FBS培养基培养24 h后，继续培养12 h；GSPB2组，更换新培养基培养24 h后，加入10 μmol/L GSPB2继续培养12 h；H2O2组，更换新培养基培养24 h后，加入终浓度为 150 μmol/L H2O2培养12 h；GSPB2+H2O2组，在新的培养基中加入终浓度为10 μmol/L GSPB2培养24 h后，加入终浓度为150 μmol/L H2O2培养12 h。上述药物使用浓度和处理时间参照已发表文献[8-9]，试验结束后收集细胞样品，部分样品用于检测miR-181a和TGFBR1表达水平，部分用于检测caspase-3活性和细胞活力。

1.2.7 细胞活力测定

将细胞接种于96 孔板中，密度为每孔2 500个细胞，每组设置6个平行孔，置37 ℃ 5% CO2细胞培养箱培养12～48 h。在每个孔中加入 20 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入200 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，利用酶标仪测定570 nm波长处各孔的吸光度(OD)值。

1.2.8 Caspase-3活性分析

将细胞悬液全部收集到1.5 mL离心管中，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞，PBS清洗1次，吸取上清液后，按照每200万细胞加入50 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30 min，期间涡旋振荡3～4次，每次10 s。在4 ℃环境下，12 000 r/min离心10 min，小心地吸取上清液转移至新的离心管中，测定caspase-3 酶活性。

1.2.9 细胞凋亡检测

使用原位末端标记法 (TUNEL)染色检测颗粒细胞凋亡情况。操作步骤和方法按照罗氏公司TUNLE试剂盒操作说明书进行。

1.2.10 荧光定量PCR

miRNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的miRcute miRNA提取分离试剂盒(DP501)。反转录使用该公司生产的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211)，荧光定量PCR检测使用该公司的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(FP411)。miR-181a-5p 定量PCR 引物(CD202-0117)和内参基因U6引物(CD201-0145)由天根生化科技(北京)有限公司合成。按照TRIzol说明书操作步骤提取RNA，用逆转录试剂盒(RR047A，TaKaRa)进行反转录，使用SYBR PremixExTaqⅡ染料法荧光定量试剂盒(RR820A，TaKaRa)进行定量PCR检测。TGFBR1引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列参考已发表文献[18]。荧光定量体系及相关参数均参照试剂盒说明书，所得Ct值均通过2-△△Ct法计算其相对表达量。

1.2.11 Western blot 分析

收集颗粒细胞，每孔加100 μL的蛋白裂解液，置冰上裂解20 min，收集至1.5 mL 离心管中，4 ℃下，12 000 r/min，离心10 min。每孔加入20 μg蛋白进行电泳，结束后将目的蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的BSA封闭2 h，分别加入cleaved caspase-3(1∶1 500)、TGFBR1(1∶1 500)和GAPDH(1∶2 000)抗体，4 ℃环境下过夜，第2天洗膜后加入HRP标记二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，CEL显色液显影蛋白，使用ImageJ 软件对检测结果进行分析。

1.3 统计分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 GSP对体内颗粒细胞增殖和miR-181a表达水平的影响

与对照组相比，免疫组化结果发现在3-NP组颗粒细胞中cleaved caspase-3阳性信号较强(图1)，cleaved caspase-3蛋白表达水平(图2C)、caspase-3活性(图2D)均显著升高(P<0.05)；同时，3-NP组颗粒细胞活力显著降低(P<0.01，图2A)，miR-181a表达水平显著升高(P<0.01，图2E)。与3-NP组比较，3-NP+GSP组的cleaved caspase-3阳性表达信号(图1)、cleaved caspase-3蛋白表达水平(图2C)、caspase-3活性(图2D)均显著降低(P<0.05)；同时，3-NP+GSP组的细胞活力显著升高(P<0.05，图2A)，miR-181a表达水平显著降低(P<0.05，图2E)。这些结果表明，体内补充GSP对卵泡颗粒细胞氧化损伤具有显著抑制作用，其机制可能与下调miR-181a表达有关。

A. Control；B. 3-NP；C. 3-NP+GSP。图1 Cleaved caspase-3的免疫组化检测(标尺=100 μm)

A.细胞活力的MTT分析；B、C. Cleaved caspase-3蛋白表达水平及量化分析；D. Caspase-3活性检测；E. miR-181a的表达变化。与对照组相比，*表示差异显著(P<0. 05)，**表示差异极显著(P<0. 01)；与模型组相比，#表示差异显著(P<0. 05)。下同。图2 GSP对小鼠卵巢颗粒细胞活力和miR-181a表达水平的影响

2.2 miR-181a对TGFBR1的靶向作用

TGFBR1 3′ UTR序列上存在与 miR-181a互补结合的位点(图3A)。与对照组和转染mimics NC组相比，转染miR-181a mimics极显著提高了miR-181a的表达水平(P<0.01，图3B)。与对照组和转染inhibitor NC组相比，转染miR-181a inhibitor极显著抑制了miR-181a的表达水平(P<0.01，图3C)。与mimics-NC组相比，TGFBR1-WT与miR-181a共转染HEK-293T细胞48 h后，相对荧光素酶活性显著下降(P<0.05)；TGFBR1-MUT与miR-181a共转染HEK-293T细胞组的相对荧光素酶活性无显著变化(图3D)。与转染NC相比，转染miR-181a mimics显著抑制了TGFBR1蛋白表达(P<0.05)，而转染miR-181a inhibitor显著提高了TGFBR1蛋白表达(P<0.05，图3F)。与对照组相比，H2O2组颗粒细胞活力显著降低；与H2O2组相比，在H2O2+miR-181a inhibitor组中颗粒细胞活力明显升高(P<0.05，图3G)。与对照组相比，H2O2组颗粒细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)；与H2O2组相比，在H2O2+miR-181a inhibitor组中颗粒凋亡率显著降低(P<0.05，图3H、3I)。上述结果表明，miR-181a与TGFBR1存在靶向关系，氧化应激条件下抑制miR-181a表达可显著改善颗粒细胞活力。

A. 靶向关系结合位点预测；B. 过表达miR-181a对其表达的变化；C. 抑制miR-181a对其表达的变化；D.双荧光素酶活性分析；E、F. 过表达或抑制miR-181a后，TGFBR1蛋白表达水平；G.抑制miR-181a后，颗粒细胞活力分析；H. 抑制miR-181a后，颗粒细胞凋亡分析(标尺=50 μm)；I. 颗粒细胞凋亡的量化分析。图3 miR-181a 与TGFBR1靶向作用关系

2.3 GSPB2对体外颗粒细胞增殖和miR-181a表达的影响

与对照组相比，H2O2氧化损伤组中颗粒细胞miR-181a表达水平和caspase-3活性极显著升高(P<0.01，图4A、4B)。同时，TGFBR1的mRNA表达水平明显下调(P<0.05，图4C)，颗粒细胞的活力极显著降低(P<0.01，图4D)。与H2O2氧化损伤组比较，H2O2+GSPB2组中miR-181a的表达水平和caspase-3活性显著降低(P<0.05，图4A、4B)，且TGFBR1的mRNA表达水平和细胞活力明显上升(P<0.05，图4C、4D)。与对照组相比，H2O2组中颗粒细胞凋亡率极显著增加(P<0.01)；与H2O2组相比，在H2O2+GSPB2组中颗粒凋亡率显著降低(P<0.05，图4E、4F)。 上述结果表明，氧化应激条件补充GSPB2可通过抑制miR-181a 调控TGFBR1表达从而改善颗粒细胞活力。

A. 不同处理中miR-181a表达水平分析；B. 不同处理中caspase-3活性分析；C. 不同处理中TGFBR1 表达分析；D. 不同处理中细胞活力分析；E. 不同处理中颗粒细胞凋亡分析(标尺=50 μm)；F. 凋亡细胞的量化分析。图4 GSPB2对颗粒细胞活力和miR-181a表达水平的影响

3 讨论

在雌性生殖系统中，氧化应激可诱导颗粒细胞凋亡，进而导致卵巢功能受损[19]。补充抗氧化剂被认为是通过控制氧化应激治疗生殖疾病和不育症的一种可能策略[20]。GSP是葡萄籽原花青素提取物的主要成分，已被证明是一种强有效的自由基清除剂[8]。研究报道，补充GSP可减轻因氧化应激诱导的小鼠肝脏细胞损伤[21]，提高人和动物颗粒细胞活性并延缓卵巢衰老[9-10]。Caspase家族在细胞凋亡过程中起着重要作用[22]。本研究利用3-NP诱导构建小鼠卵泡氧化损伤模型[6]，发现3-NP组颗粒细胞活力显著低于对照组，同时免疫组化和Western blot检测cleaved caspase-3蛋白水平，提示卵泡颗粒细胞氧化损伤。当体内补充GSP进行干预处理时，颗粒细胞活力明显上升，caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平显著降低，卵泡颗粒细胞氧化损伤明显减轻，这表明GSP能够缓解卵泡颗粒细胞氧化损伤，从而提高卵泡发育质量，改善卵巢内分泌功能。

miRNA是一类具有负调控功能的非编码微小RNA，在各种生理过程或病理过程中具有非常重要的调控作用[23]。miR-181a是一种存在于人类、小鼠和猪等多种物种中的高度保守的miRNA[13，15]，参与多种细胞的增殖以及凋亡过程，并在细胞的生长代谢中发挥关键的调控作用。miR-181a已被证实对多种细胞的增殖过程起到抑制作用，如Liu等[24]研究表明miR-181a可抑制间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的增殖；Zhang等[2]研究发现miR-181a可抑制人和小鼠颗粒细胞的增殖。因此下调miR-181a很可能是一个潜在的细胞氧化损伤的治疗策略。本研究发现，体内3-NP处理，体外H2O2处理，均可使颗粒细胞中miR-181a表达水平较对照组显著上调；而经GSP和GSPB2干预分别能有效对抗3-NP和H2O2处理引起颗粒细胞中miR-181a的上调，这表明GSP对氧化应激诱导颗粒细胞凋亡的保护作用很可能是通过降低miR-181a的表达来实现的。

TGFBR1是TGF-β/Smad信号通路中的重要成员，在哺乳动物卵泡发育和排卵过程中发挥重要作用[13]。Zhou等[25]研究发现，颗粒细胞中TGFBR1表达量与猪卵泡发育大小呈正相关；Li等[26]研究表明，多羔湖羊卵巢中TGFBR1的表达水平极显著高于单羔湖羊，且与排卵数呈显著正相关。我们利用在线软件TargetScan和miRanda查询发现miR-181a与TGFBR1 mRNA 3′UTR存在互补结合，同时双荧光素酶报告基因结果分析显示，miR-181a与TGFBR1存在靶向关系；并且进一步证实，转染miR-181a mimics显著抑制了TGFBR1蛋白的表达，转染miR-181a inhibitor颗粒细胞活力较H2O2组明显升高，以上结果表明miR-181a通过靶向抑制TGFBR1表达，进而影响了颗粒细胞增殖活性。

综上所述，氧化应激条件下GSP可能下调miR-181a表达，从而激活miR-181a的靶蛋白TGFBR1及其介导的下游相关信号通路分子，发挥对颗粒细胞氧化损伤的保护作用。