紫玉兰树皮中的生物碱类成分

孔令涛，赵超越，夏璐瑶，贾献慧，白著双，唐文照

紫玉兰树皮中的生物碱类成分

孔令涛，赵超越，夏璐瑶，贾献慧，白著双，唐文照*

山东第一医科大学药学院（药物研究所）；先进药物递释系统全国重点实验室；国家卫健委生物技术药物重点实验室；山东省罕少见病重点实验室，山东 济南 250117

研究紫玉兰树皮的生物碱类化学成分。采用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱以及制备HPLC等分离方法进行分离纯化，根据波谱数据鉴定化合物结构。利用MTT法测试化合物对人肺癌A549细胞的细胞毒活性。从紫玉兰树皮中分离得到6个生物碱类化合物，分别鉴定为()--(4′-(4′′-formyl-1′′- (hydroxymethyl)-1-pyrrol)butyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide（1）、magnolamide（2）、--feruloytyramine（3）、dicentrinone（4）、liriodenine（5）、lysicamine（6）。其中化合物1～3属于有机胺类生物碱，4～6属于阿朴菲类生物碱。生物活性测试结果表明化合物4～6可明显抑制A549细胞增殖，半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）分别为8.17、15.33与11.05 μmol/L。化合物1为新化合物，命名为紫玉兰碱，化合物5为首次从木兰属植物中分离得到，化合物2、4～6为首次从该植物中分离得到。3个阿朴菲类生物碱（4～6）对A549细胞具有较强的细胞毒活性。

紫玉兰；有机胺生物碱；阿朴菲生物碱；细胞毒活性；紫玉兰碱；liriodenine

紫玉兰Desr. 为木兰科木兰属Linn. 植物，落叶灌木，产于福建、湖北、四川、云南等省份，现已被作为观赏花卉树种或行道树广泛引种。紫玉兰的树皮、叶、花蕾均可入药，其花蕾民间用于治疗鼻塞、风寒头痛等症，在多地当作中草药辛夷使用[1]。目前紫玉兰化学成分的研究主要集中在花蕾和叶部位，发现了多种木脂素类以及挥发油成分[2-3]，但是，对该植物树皮中的化学成分研究未见报道。本实验对紫玉兰树皮部位的化学成分进行系统研究，运用多种色谱分离手段，从紫玉兰树皮的95%乙醇和酸水提取物中首次分离得到6个生物碱类成分，分别鉴定为()-- (4′-(4′′-formyl-1′′-(hydroxymethyl)-1-pyrrol) butyl)- 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acrylamide（1）、magnolamide（2）、--feruloytyramine（3）、dicentrinone（4）、liriodenine（5）、lysicamine（6），包括3个有机胺类生物碱（1～3）和3个阿朴菲类生物碱（4～6），其中化合物1为新化合物（图1），命名为紫玉兰碱；化合物5为首次从木兰属植物中分离得到，化合物2、4～6为首次从该植物中分离得到。采用MTT法测定6个化合物对人肺癌A549细胞的细胞毒活性，结果显示3个阿朴菲类生物碱抑制A549细胞增殖的活性较好，半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值分别为8.17、15.33与11.05 μmol/L。

图1 化合物1的结构 (a)及其关键性的HMBC (b,)与1H-1H COSY (b, )

1 仪器与材料

Bruker Avance 800 MHz（Bruker公司，瑞士）；SCIEX AB X500R型液-质联用仪；Thermo ultimate 3000分析型高效液相色谱仪，色谱柱为（250 mm×4.6 mm，5 µm，GLScience）；SPD-20A制备型高效液相色谱仪（日本岛津公司），色谱柱为（250 mm mm×4.6 mm，5 µm，GLScience）；柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂，200～300目）；GF254薄层色谱硅胶板（临沂市海洋化工厂）；Sephadex LH-20（Amersham Biosciences公司，瑞典）；ODS柱色谱填料（50～75 µm，YMC公司）色谱级甲醇（美国天地有限公司）；分析级甲醇（天津市永大化学试剂有限公司）。

紫玉兰Desr. 树皮于2021年10月采自山东临沂，药材经由山东中医药大学辛义周主任药师进行鉴定，标本（20211003m）存放在山东第一医科大学药学院药材标本室。

2 提取与分离

紫玉兰树皮13 kg，干燥，粉碎后用95%乙醇冷浸提取3次，每次3 d，合并提取液，减压蒸馏，除去有机溶剂，将提取物分散于水中，再用二氯甲烷萃取。二氯甲烷部位回收溶剂后得二氯甲烷部位（35.7 g）。将95%乙醇提取完的药渣浸泡于1%（30 L）的盐酸溶液中，浸泡48 h后将酸水提取液调节pH＝10，再用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷提取液，减压回收溶剂后得酸水部位（18.0 g）。

二氯甲烷部位（35.7 g）进行硅胶柱色谱，以二氯甲烷–甲醇（100∶0→7∶3）梯度洗脱，经薄层色谱分析，合并相同组分得Fr. 1～5。Fr. 5（19.6 g）经ODS柱色谱，以甲醇-水50%～100%梯度洗脱，得Fr. 5.1～5.8。Fr. 5.5（201 mg）经硅胶柱色谱，以石油醚-醋酸乙酯（8∶2→1∶1）梯度洗脱得Fr. 5.5.1～5.5.6。Fr. 5.5.3经HPLC制备（甲醇-水52∶48），得到化合物1（15.14 mg，R＝23 min）和2（120.7 mg，R＝40 min）。Fr. 5.5.4经HPLC制备（甲醇-水53∶47），得到化合物3（38.02 mg，R＝35 min）。

酸水部位用硅胶（200～300目）拌样进行硅胶柱色谱，以二氯甲烷–甲醇（100∶0→6∶4）梯度洗脱，经薄层色谱分析，合并相同组分，得Fr. 1～5。Fr. 4（423 mg）经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（50∶1）洗脱，再经ODS柱色谱，以甲醇-水40%→100%梯度洗脱，得化合物6（8.0 mg）。剩下的部分用甲醇溶解，经HPLC制备（甲醇-水60∶40），得化合物4（6.1 mg，R＝35 min）。Fr. 5（1 g）经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（100∶0→30∶1）梯度洗脱，经TLC检测合并相同部分，得Fr. 5.1～5.9。Fr. 5.9经反复硅胶柱色谱，以环己烷-醋酸乙酯（8∶2）洗脱，甲醇溶解后经HPLC制备（甲醇-水70∶30），得到化合物5（10 mg，R＝25 min）。

3 活性测试

采用MTT法对分离得到的化合物进行抑制肺癌细胞增殖的活性评价，以顺铂为阳性对照药，取A549指数生长期细胞经洗涤后，用0.25%胰蛋白酶消化后计数，调整细胞数为1×105/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔1×104个，置37 ℃、CO2培养箱内培养过夜。培养24 h后弃去原培养液，加入含有不同浓度样品的培养基，样品依次用DMEM完全培养基稀释，每个浓度设3个复孔。空白对照组加入与给药组相对应浓度DMSO的完全培养基，用顺铂作为阳性对照组。在37 ℃、CO2培养箱内培养48 h后，向每孔加入MTT储备液（质量浓度为0.5 mg/mL），37 ℃继续孵育3～4 h，倾去孔内的液体并向每孔加入150 μL DMSO，避光于温室下充分振荡，使蓝紫色甲瓒结晶溶解，10 min内用全自动酶标仪检测570 nm处各孔的吸光度（）值，以对照组为参考，计算不同浓度药物的抑制率，并计算IC50。

抑制率=1－给药/对照

4 结构鉴定

表1 化合物1与2的1H-和13C-NMR数据(800/200 MHz, CDCl3)

化合物2：淡黄色油状液体，分子式C20H24N2O5，HRESIMS/: 373.143 0 [M＋H]+，1H- 与13C-NMR数据见表1。以上数据与文献报道一致[4]，故鉴定化合物2为magnolamide。

化合物3：淡黄色油状液体，HRESIMS/: 373.143 0 [M＋H]+。1H-NMR (800 MHz, CD3OD): 6.55 (1H, s, H-2), 6.24 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.46 (1H, d,= 8.2 Hz, H-6), 6.89 (1H, d,= 15.6 Hz, H-7), 5.86 (1H, d,= 15.6 Hz, H-8), 4.39 (3H, s, 3-OCH3), 6.17 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.50 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3′, 5′), 2.20 (2H, t,= 7.4 Hz, H-7′), 2.92 (2H, t,= 7.4 Hz, H-8′)；13C-NMR (200 MHz, CD3OD): 128.2 (C-1), 111.5 (C-2), 149.3 (C-3), 150.0 (C-4), 116.5 (C-5), 123.3 (C-6), 142.1 (C-7), 118.7 (C-8), 169.2 (C-9), 131.3 (C-1′), 130.8 (C-2′,6′), 116.3 (C-3′,5′), 156.9 (C-4′), 35.8 (C-7′), 42.6 (C-8′), 56.4 (3-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[5]，故鉴定化合物3为--feruloytyramine。

化合物4：橙色针状结晶（甲醇），HRESIMS/: 276.052 0 [M＋H]+。1H-NMR (800 MHz, DMSO-6): 7.21 (1H, s, H-3), 8.06 (1H, d,= 5.1 Hz, H-4), 8.82 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5), 8.57 (1H, d,= 7.7 Hz, H-8), 7.66 (1H, t,= 7.7 Hz, H-9), 7.75 (1H, t,= 8.1 Hz, H-10), 8.66 (1H, d,= 8.1 Hz, H-11), 6.32 (2H, s, -OCH2O-)；13C-NMR (200 MHz, DMSO-6): 148.3 (C-1), 151.5 (C-2), 103.0 (C-3), 124.4 (C-4), 145.0 (C-5), 182.3 (C-7), 128.3 (C-8), 128.8 (C-9), 133.9 (C-10), 126.7 (C-11), 108.2 (C-1a), 145.6 (C-3a), 122.3 (C-1b), 136.0 (C-6a), 131.3 (C-7a), 132.8 (C-11a), 103.1 (-OCH2O-)。以上波谱数据与文献报道基本一致[6]，故鉴定化合物4为dicentrinone。

化合物5：橙色针状结晶（甲醇），分子式C19H13NO5，HRESIMS/: 336.082 6 [M＋H]+。1H-NMR (800 MHz, DMSO-6): 7.54 (1H, s, H-3), 7.71 (1H, d,= 5.1 Hz, H-4), 8.81 (1H, d,= 5.1 Hz, H-5), 7.81 (1H, s, H-8), 8.14 (1H, s, H-11), 6.36 (2H, s, -OCH2O-), 4.01 (3H, s, 9-OCH3), 3.97 (3H, s, 10-OCH3)；13C-NMR (200 MHz, DMSO-6): 147.3 (C-2), 102.8 (C-3), 124.4 (C-4), 144.9 (C-5), 180.9 (C-7), 108.6 (C-8), 148.8 (C-9), 153.6 (C-10) , 109.3 (C-11), 108.2 (C-1a), 135.8 (C-3a), 122.9 (C-1b), 145.5 (C-6a), 127.6 (C-7a), 125.6 (C-11a), 102.4 (-OCH2O-), 56.1 (9-OCH3), 56.3 (10-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定化合物5为liriodenine。

化合物6：绿色针状结晶（甲醇），分子式：C18H13NO3，HRESIMS/: 292.082 2 [M＋H]+。1H-NMR (800 MHz, DMSO-6): 7.66 (1H, s, H-3), 8.12 (1H, d,= 5.2 Hz, H-4), 8.87 (1H, d,= 5.2 Hz, H-5), 8.48 (1H, dd,= 8.4, 1.2 Hz, H-8), 7.65 (1H, t,= 8.4, 1.2 Hz, H-9), 7.89 (1H, t,= 8.4, 1.2 Hz, H-10), 9.15 (1H, dd,= 8.4, 1.2 Hz, H-11), 4.11 (3H, s, 1-OCH3), 4.04 (3H, s, 2-OCH3)；13C-NMR (200 MHz, DMSO-6): 145.2(C-1), 157.8 (C-2), 108.4 (C-3), 125.6 (C-4), 145.0 (C-5), 182.2 (C-7), 128.8 (C-8) , 129.6 (C-9), 135.3 (C-10), 129.6 (C-11), 157.6 (C-3a), 155.3 (C-6a), 123.0 (C-6b), 132.6 (C-7a), 135.5 (C-11a), 118.7 (C-11b), 61.1 (1-OCH3), 57.0 (2-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物6为lysicamine。

5 细胞毒活性

对活性数据进行分析，结果显示化合物4～6对A549细胞的增殖具有明显的抑制活性，IC50值分别为8.17、15.33与11.05 μmol/L，活性稍弱于阳性对照药顺铂（IC50为6.05 μmol/L），其余化合物（1～3）没有抑制A549细胞增殖的活性（IC50＞50 μmol/L）。

6 讨论

本研究采用多种色谱方法从紫玉兰树皮中分离得到6个生物碱类成分，包括3个有机胺类生物碱和3个阿朴菲类生物碱，其中化合物1为新化合物，除化合物3外，其余化合物都是首次从紫玉兰中分离得到，丰富了该植物中化学成分的结构类型。通过活性筛选，发现其代谢产生的阿朴菲类生物碱具有显著的细胞毒活性，为进一步研究紫玉兰的药效物质，促进该植物资源的综合利用提供了科研基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Alkaloids from stem barks of

KONG Ling-tao, ZHAO Chao-yue, XIA Lu-yao, JIA Xian-hui, BAI Zhu-shuang, TANG Wen-zhao

School of Pharmaceutical Sciences & Institute of Materia Medica, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, National Key Laboratory of Advanced Drug Delivery System, Key Laboratory for Biotechnology Drugs of National Health Commission (Shandong Academy of Medical Sciences), Key Lab for Rare & Uncommon Diseases of Shandong Province, Jinan 250117, China

To study alkaloids from the stem barks ofwith their cytotoxicity on lung cancer cells A549.Compounds were isolated and purified by various chromatographic techniques, including silica gel, ODS, Sephadex LH-20 and preparative HPLC. Their structures were elucidated via spectroscopic data analysis. Cytotoxicity on lung cancer cells A549 was evaluated by MTT experiment.Three organic amine alkaloids (1—3) and three apophenoid alkaloids (4—6) were isolated. They were identified as magnoliliamide (1), magnolamide (2),--feruloytyramine (3), dicentrinone (4), liriodenine (5) and lysicamine (6). Bioactive results showed that compounds 4, 5 and 6 had good inhibitory activity on A549 cell line with IC50values of 8.17, 15.33 and 11.05 μmol/L.Compound 1 is a new compound and named magnoliliamide, compound 5 is isolated from the genus offor the first time, and compounds 2, 4, 5 and 6 are firstly obtained from this plant. Three aporphine alkaloids (4—6) have strong cytotoxicity on the proliferation of A549 cells.

Desr.; organic amine alkaloids; aporphine alkaloids; cytotoxicity; magnoliliamide; liriodenine

R284.1

A

0253 - 2670(2023)20 - 6587 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.003

2023-07-21

国家自然科学基金青年基金资助项目（21907059）；山东第一医科大学学术提升计划（2019LJ003）

孔令涛（1998—），男，硕士研究生，从事天然药物化学研究。E-mail: 3107575997@qq.com

通信作者：唐文照（1973—），男，教授，研究生导师，从事天然活性成分研究与中药质量标准研究。E-mail: twzsd@sina.com

[责任编辑 王文倩]