茉莉叶总黄酮不同提取方法比较及其抑菌活性研究

范丽丽林翠英林嘉琦梁滢聂旭莲陈仪新詹源菲

(1.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200；2.广西中医湿病方药理论与转化重点实验室，广西 南宁 530200；3.农作物废弃物功能成分研究协同创新中心，广西 南宁 530200；4.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011；5.5.郑州大学公共卫生学院，河南 郑州 450001；6.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001；7.广西中医药大学学科建设办公室，广西 南宁 530200)

茉莉叶为木犀科素馨属植物茉莉[Jasminum sambac(L.)Ait.]的叶，茉莉花是广西区域特色药材，广西横州市是我国茉莉花的主产地区。茉莉花的根、叶、花均有药用价值。其中，茉莉叶性辛、凉，归肺、胃经，具有清热解表、消肿止痛功效，常被用于治疗外感发热、腹胀腹泻、毒虫蛰伤等病症。茉莉叶含有多种化学成分，目前研究发现，主要包括三萜类、黄酮类、酚类等化学成分[1]，其中，黄酮类化合物更可能是其主要药效成分。目前对茉莉叶总黄酮的研究主要在提取工艺的优化和其抗氧化作用方面，提取方法有乙醇浸提法[2]、超声乙醇回流提取法[3]、超声乙醇浸提法[4]，暂未见有超声联合酶解法来提取茉莉叶总黄酮。超声联合酶解法是近年来从植物中提取总黄酮中应用较为普遍的方法[5]。因此，本文以超声提取法为实验对照，比较超声联合酶解提取方法的总黄酮提取率，得出提取茉莉叶中总黄酮的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茉莉叶，采摘自广西横州市，经广西中医药大学药用植物教研室汝梅博士鉴定为正品；芦丁标准品，中国药品生物制品检定所；纤维素酶，河南万邦化工科技有限公司；果胶酶，河南万邦化工科技有限公司；一水合柠檬酸，分析纯，成都金山化学试剂有限公司；硝酸铝，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；柠檬酸三钠二水，分析纯，成都市科隆化学品有限公司；95%乙醇，成都市科隆化学品有限公司；亚硝酸钠，分析纯，天津博迪化工有限公司；氢氧化钠，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；大豆蛋白胨，北京索莱宝科技有限公司；酵母膏，北京奥博星生物有限责任公司；葡萄糖，分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；硫酸庆大霉素注射液，河南润弘制药股份有限公司。

1.2 仪器与设备

超声清洗机，YT1030型，深圳云奕科技股份有限公司；数显恒温水浴锅，HH-4型，常州国华电器有限公司；粉碎机，QE-10型，浙江屹立工贸有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，DNG-905310型，上海精宏实验设备有限公司；电子天平，BSA224S型，赛多利斯科学仪器；紫外可见分光光度计，759S型，上海仪电科学仪器股份有限公司；pH计，PHS-3E型，上海仪电科学仪器股份有限公司；循环水真空泵，SHZ-D(Ⅲ)型，邦西仪器科技(上海)有限公司；低速多管架自动平衡离心机，TDZ5-WS型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，YXQ-LS-50S11型，上海迅实实业有限公司医疗设备厂；恒温培养振荡器，ZWY-240型，上海智诚分析仪器制造有限公司；生化培养箱，LRH-250A型韶关市泰宏医疗器械有限公司；洁净工作台，SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 茉莉叶总黄酮提取工艺优化

选择无破损的新鲜茉莉叶，放入鼓风式恒温干燥箱，60℃下烘干2h，放入粉碎机进行粉碎成粉，过100目筛，存放于保鲜袋中。称量1.0000g茉莉叶干粉于烧杯中，分别采用超声提取法和超声联合酶解法按照正交设计对茉莉叶总黄酮进行单次提取，考察其提取率。采用硝酸铝比色法测定总黄酮的含量。

1.3.2 测定方法

1.3.2.1 标准曲线的制作

精密吸取已经配制好的芦丁对照液(0.10mg·mL-1)0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL于容量瓶中，加0.30mL 5%NaNO2溶液，静置6min，加0.30mL 10%Al(NO3)3溶液，静置6min，4.00mL 4%NaOH溶液，滴加60%乙醇至刻度摇匀，静置12min，利用紫外分光光度计于510nm处测定其吸光度，每个平行测3次[4]。所得到的回归方程：

y=10.98x-0.0133，R2=0.9996

式中，y为吸光度；x为芦丁标准液浓度，mg·mL-1。

1.3.2.2 茉莉叶总黄酮的含量测定

精确吸取0.5mL离心后得到的上层清液于10mL容量瓶中，用相应体积分数的乙醇溶液定容。按照1.3.2.1标准曲线绘制项下的显色方法，测量每个样品的吸光度值，依据得到的标准曲线回归方程计算样品中的总黄酮含量，计算茉莉叶中总黄酮的提取率，公式：

总黄酮得率/%=(nCV/1000m)×100%[6]

式中，C为总黄酮质量浓度，mg·mL-1；n为提取液稀释倍数；V为提取液的体积，mL；m为茉莉叶的质量，g。

1.3.2.3 单因素实验设计

具体见表1～3。

表2 超声提取法单因素实验因素水平

表3 基于超声提取法最优工艺联合酶解单因素实验因素水平

1.3.2.4 正交实验设计

具体见表4、表5。

表4 超声提取法正交实验因素水平

表5 超声提取法正交实验因素水平

表6 基于超声提取法最优工艺联合酶解正交实验因素水平

1.3.3 茉莉叶总黄酮抑菌活性实验

1.3.3.1 最小抑菌浓度(MIC)测定

测定方法采用微量肉汤稀释法，用排枪将液体培养基100μL加到96孔板A-D排的1～12孔，取茉莉叶总黄酮提取液100μL加到96孔板A～D排的第1孔，用移液枪连续吹打混匀后，再取100μL加入第2孔，反复进行2倍稀释至第10孔，第10孔混匀后吸取100μL弃去。将菌悬液分别加到96孔板B-D排1～11孔，充分混合均匀加盖，A排为阳性对照，B～D排为3组平行对照，只加提取液和培养基的第11孔作阳性对照，观察该浓度的菌液在培养期间是否生长良好；加100μL培养基的第12孔作阴性对照，用以观察培养基在实验操作期间是否被污染；在37℃恒温培养箱中培养24h，观察实验组和对照组菌液生长情况并计算MIC[7-10]。

1.3.3.2 纸片扩散法

纸片扩散法，将直径为6mm的圆形药敏纸片放入干净的三角瓶用封口膜封上，在高压蒸汽锅中灭菌20min后烘干，分别浸入浓缩的茉莉叶总黄酮提取液、庆大霉素、无菌水中充分吸收；移液枪移取100μL菌悬液到固体培养基表面，用涂布棒均匀涂布，在平板底部分成4个区域并作标记；将含有茉莉叶总黄酮提取液的纸片贴于平板，用含有庆大霉素和无菌水的纸片分别作阳性对照和空白阴性对照，重复3组试验，完成后将平板放置到4℃的冰箱中使之充分渗透2h后，取出倒置在恒温培养箱中，37℃，培养24h，观察结果并采用“十字交叉法”测量抑菌圈直径[7]。

2 结果与分析

2.1 超声提取法单因素实验

具体见图1。

图1 超声提取法单因素实验

2.2 超声联合酶解法提取法单因素实验

具体见图2。

图2 超声联合酶解法提取法单因素实验

2.3 基于超声提取法最优工艺联合酶解单因素实验

具体见图3。

图3 基于超声提取法最优工艺联合酶解单因素实验

2.4 超声提取法提取总黄酮的最佳工艺

在单因素实验结果的基础上，以料液比、乙醇体积分数和超声时间为考察因素，在功率600W、频率40kHz、60℃的条件进行超声后，4000r·min-1离心10min，按照1.3.2.1的方法进行总黄酮含量测定。选择L9(34)正交正交设计实验，结果见表7，方差分析见表8。

表7 正交L9(34)实验结果

表8 方差分析表

由表7可知，使用超声提取法提取时，影响提取率的主次顺序为C>B>A，最佳组合为A2B2C3，即最佳工艺条件为提取时间4.5h，料液比1∶45，乙醇体积分数为85%。由表8可知，A、B、C三者对实验结果均有显著性影响(P<0.05和P<0.01)，其中料液比和乙醇体积分数对本实验结果影响有极显著差异。

2.5 超声联合酶解法提取总黄酮的最佳工艺

在单因素实验结果的基础上，以酶解pH、料液比、乙醇体积分数和超声时间为考察因素。在纤维素酶∶果胶酶=1∶1(添加量为8%)，50℃下酶解75min，使用超声法进行提取，超声功率为600W，频率为40kHz，温度为60℃，按照1.3.2.1的方法进行总黄酮含量测定。根据L9(34)正交表设计正交实验，结果见表9，方差分析见表10。

表9 正交L9(34)实验结果

表10 方差分析表

由表9可知，使用超声联合酶解法提取时，4个因素中影响提取率的主次顺序为A>C>B>D，最佳组合为A3B3C2D1，即最佳提取工艺条件为酶解的pH为6，料液比为1∶50，乙醇体积分数75%，超声1.5h。由表10可知，A、B、C、D 4个因素对本实验均有显著性影响(P<0.01)，其中酶解pH、料液比和乙醇体积分数对本实验结果影响最大。

2.6 基于超声提取法最优工艺联合酶解正交实验

在单因素实验结果的基础上，以2.4中超声提取法的最优工艺为基础条件，以酶用量、酶解时间、酶解温度为考察因素，按照1.3.2.1的方法进行总黄酮含量测定。根据L9(34)正交表设计正交实验，结果见表11。

表11 正交L9(34)实验结果

2.7 提取方法比较

通过正交实验优化的结果可以看出超声提取法的最优组合A2B2C3，基于超声最优条件下联合酶解法的最优组合为A3B1C3，分别进行单次提取每组实验重复3次，取平均值，结果见表12。

表12 茉莉叶总黄酮不同提取方法的提取率比较

表13 茉莉叶总黄酮的抑菌圈直径

由表12可知，以超声提取法和超声联合酶解法的提取率分别为1.80%和3.63%，即使用超声提取法基础上联合酶解提取茉莉叶总黄酮得率较高。

2.8 茉莉叶总黄酮抑菌活性

茉莉叶总黄酮的MIC为2.30mg·mL-1。抑菌圈直径的测量采用“十字交叉法”，每组抑菌试验使用游标卡尺对其进行3次测量取平均值。判定标准：抑菌圈直径≥20mm为高度敏感；10～19mm为中度敏感；10mm以下为不敏感。茉莉叶总黄酮含量为36.85mg·mL-1时的抑菌圈直径为16.6±0.50mm，>10mm，故茉莉叶总黄酮含量为36.85mg·mL-1对金黄色葡萄球菌有中度敏感的抑制作用。

3 结论与结论

超声提取法、超声联合酶解法和基于超声提取法最优工艺联合酶解法提取茉莉叶总黄酮的最佳工艺：超声提取法，料液比1∶45，乙醇体积分数为85%，提取时间4.5h；超声联合酶解法，酶解pH为6，料液比为1∶50，乙醇体积分数75%，超声时间1.5h；基于超声提取法最优工艺联合酶解法，酶用量为5%，酶解时间为90min，酶解温度为65℃。超声联合酶解法与超声提取法提取率相差不大，但超声联合酶解法提取率所用的提取时间相对更短，可节约成本。基于超声提取法最优工艺联合酶解法可使提取率从1.80%提升至3.63%，表明基于超声提取法最优工艺联合酶解法可提升茉莉叶总黄酮提取率。对茉莉叶总黄酮进行抑菌活性测定，其含量为36.85mg·mL-1时的抑菌圈直径为16.6±0.50mm，MIC为2.30mg·mL-1，说明茉莉叶总黄酮具有一定的抑菌活性。

黄酮作为重要的植物天然活性成分，资源丰富易于提取，且具有广泛的药理活性，目前还有将黄酮添加进化妆品、健康食品等研究，茉莉花作为广西区域特色药材，资源丰富但茉莉叶利用率较低，常作为农作物废弃物进行丢弃，造成大量资源浪费。本研究仅对茉莉叶总黄酮的提取工艺、抑菌活性进行了考察，后续还将进行黄酮成分鉴定，并结合体内实验研究探寻其物质基础和作用机制，为其在健康产品及医药行业的综合开发利用奠定基础。