液质联用检测老酸奶和牛轧糖中三聚氰胺的研究

刘超，吕雪梅，景赞

乐山市食品药品检验检测中心（乐山 614000）

三聚氰胺，简称三胺，俗称蜜胺、蛋白精。三聚氰胺是一种白色的单斜晶体，几乎无味，微溶于水，可溶于甲醇、吡啶、乙酸、甲醛、甘油等有机溶剂，不溶于醚类、丙酮。三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化工原料，其主要用途可以用于生产三聚氰胺甲醛树脂。由于三聚氰胺有毒，会对人体造成很大危害，因此在对于食品的加工环节时，三聚氰胺被禁止加入食品中。

乳制品中大多可能含有三聚氰胺，要想检测出三聚氰胺，可采用气相色谱-质联用法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用法、液相色谱法、酶联免疫法等。

试验采用液相色谱-质谱联用法，会产生一定的基质效应。基质效应指样品中除待测组分之外的其他组分（基质），经常会对待测组分的分析造成一定的干扰，会对待测组分的测定造成增强或者抑制。因此需对其产生的基质效应进行评价，并采用外标法或者内标法对其进行消除。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

LC-20UFLC/API3200液相色谱-质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）；XH-C旋涡混合器（广州前旗电子科技有限公司）；DVG-9076B电热恒温鼓风干燥箱（上海岩硎仪器制造有限公司）；HSC-H氮吹仪（福建欢仪有限公司）；TGL16N高速冷冻离心机（广西顾宁仪器有限公司）；LSPE-13固相萃取仪（福建叶翎仪器有限公司）；SHA-C水浴恒温振荡器（上海冠德精仪仪器有限公司）；KQ-700数控超声波清洗器（上海双旭电子有限公司）；TGL-16台式高速冷冻离心机（北京娜维斯仪器有限公司）；HN-6数显恒温水浴锅（杭州尹思特诺仪器制造有限公司）。

1.2 材料与试剂

三聚氰胺标准品（纯度 99.0%，批号 G133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺内标标准品（Melamine-13 C3，100 μg/mL，CAS号1173022-88-2）；甲醇、乙腈（均为色谱纯）；三氯乙酸（分析纯）；老酸奶、牛轧糖（购于乐山家家乐超市）。

1.3 试验条件

色谱柱采用强阳离子交换与C18混合填料，混合比例（1︰4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流动相为乙酸铵溶液-乙腈（1︰1，V/V），乙酸调至pH 3；进样体积10 μL；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；扫描方式ESI+；离子喷雾电压4 500 V；气帘气30 psi；雾化气30 psi；辅助加热气30 psi；离子化温度450 ℃。

表1 三聚氰胺及其内标质谱参数

1.4 试验方法

样品经2.1的方法溶解后，参照GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》[14]第二法液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）法中4.4.1.1提取方法进行提取、4.4.2净化方法进行净化。

1.5 标准溶液的配制

三聚氰胺标准储备液：准确称取10 mg三聚氰胺标准品至10 mL容量瓶中，用甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成质量浓度1 mg/mL的三聚氰胺储备液。

三聚氰胺内标储备液：准确吸取1 mL三聚氰胺内标溶液至10 mL容量瓶中，甲醇水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成质量浓度10 μg/mL的三聚氰胺内标储备液。

2 结果与分析

2.1 胶基的溶解

由于乳制品老酸奶、牛轧糖中均含有胶基，无法直接提取三聚氰胺，需将老酸奶、牛轧糖中所含的胶基溶解后进行三聚氰胺的提取。在对老酸奶、牛轧糖样品中所含胶基进行溶解的探究过程中，尝试3种方法。称取1 g老酸奶、牛轧糖样品各3份，置于50 mL塑料离心管中，分别用3 L纯水、2 mL纯水+2 mL 95%乙醇、3 mL 60%甲醇作溶剂[4]，在恒温水浴锅中加热10 min后，观察老酸奶、牛轧糖等样品的溶解情况，选出溶解胶基的最佳试剂，结果见表2。

表2 老酸奶、牛轧糖溶解情况

由表2说明：纯水对老酸奶、牛轧糖胶基的溶解效果最好，原因可能是老酸奶、牛轧糖中均含有明胶，明胶是一种大分子物质并且易与水结合，虽然3种溶解试剂中均含有水，但明胶不溶于乙醇；甲醇易被氧化生成甲醛，明胶遇到甲醛时，明胶成为不可逆的凝状胶体，且不溶于水，3种溶解试剂中纯水溶解效果较好。故后续试验采用3 mL纯水作溶剂溶解乳制品老酸奶、牛轧糖样品中所含胶基。

2.2 基质效应的评价

采用提取后添加法测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度分析物的离子响应强度，通过式（1）计算二者相对比值评价基质效应。

式中：A和B分别表示纯溶剂与基质溶液中分析物的峰面积；若B/A＞1，表示基质对分析物的响应产生增强效应；若B/A＜1，表示基质对分析物的响应产生抑制效应；若B/A=1，表示不存在基质效应。B/A介于0.8～1.2时，可不用消除基质效应；B/A＜0.8或B/A＞1.2，基质效应干扰强烈[5]，需要消除或降低基质效应对检测结果的影响。

表3数据表明：试样中基质效应均＜0.8，表明基质对分析物的响应产生抑制效应，且因基质效应远小于0.8，表明基质效应的干扰强烈，需要消除或降低基质效应对检测结果的影响，否则试验结果偏差较大。

表3 基质效应的评价

2.3 外标法对基质效应的消除

2.3.1 随行加标

分别称取1 g老酸奶、牛轧糖样品置于6支50 mL离心管，编号。样品经2.1的方法溶解后，分别加入一定量的三聚氰胺标准中间液，按照1.4进行样品处理，配制成标准质量浓度分别为1，2，4，8，16和20 ng/mL这6个标样。另取9个空白样品，分别配成质量分数2，5和10 μg/kg的低、中、高3组水平，做三水平三平行加标回收试验，结果见表4。

表4 外标法加标回收率、精密度（n=3） 单位：%

2.3.2 基质配标

设置1～6号空白试样，分别称取1 g老酸奶、牛轧糖样品置于6支50 mL离心管，按2.1的方法溶解后，按1.4对老酸奶和牛轧糖进行样品处理，配制成6个空白溶液，用空白溶液配制成标准质量浓度1，2，4，8，16和20 ng/mL这6个标样。进液质联用仪，测定对应的峰面积，以三聚氰胺浓度为横坐标，以三聚氰胺峰面积为纵坐标，绘制得三聚氰胺标准曲线。另取9个空白样品，分别设置成浓度2，5和10 μg/kg的低、中、高3组水平，做三水平三平行加标回收试验，结果见表4。

2.4 内标法对基质效应的消除

取6个10 mL容量瓶，分别加入一定量的三聚氰胺标准溶液，每个容量瓶中加入一定量的三聚氰胺内标中间液，配制成三聚氰胺质量浓度为1，2，4，8，16和20 ng/mL的标点，每份溶液含内标质量浓度为10 ng/mL。以三聚氰胺浓度为横坐标，三聚氰胺与内标物峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。测定对应的峰面积，绘制得到标准曲线。另分别设置低、中、高3组试样，每组试样中取3个溶解后的样品各加入20 μL三聚氰胺内标物，低浓度2.434 μg/kg、中浓度5.079 μg/kg和高浓度10.16 μg/kg这3组试样。每组样品重复测定3次，测定其平均加标回收率，结果见表5。

表5 内标法加标回收率、精密度（n=3） 单位：%

结果表明，内标法所测得的三聚氰胺平均加标回收率均在100%左右，均高于外标法所测得的平均加标回收率，表明内标法准确度好，彻底消除因基质效应对结果的影响。

2.5 方法学验证

2.5.1 三聚氰胺及其内标质谱图

如图1～图3所示，三聚氰胺及其内标母离子分别为127.1和130.2，三聚氰胺子离子特征离子峰选取68.0和85.0，三聚氰胺内标子离子特征离子峰为70.1和87.1。在此条件下，三聚氰胺及其内标物响应值最高。

图1 三聚氰胺及其内标一级质谱图

图2 三聚氰胺内标二级质谱图

图3 三聚氰胺二级质谱图

2.5.2 标准曲线方程和线性范围

准确吸取不同体积的三聚氰胺标准溶液剂内标溶液，用甲醇水（1+1，V/V）配制成三聚氰胺质量浓度1，2，4，8，16和20 ng/mL的标点，每份溶液含内标浓度10 ng/mL。以三聚氰胺浓度为横坐标，三聚氰胺与内标物峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表6。

表6 三聚氰胺标准曲线 单位：%

2.5.3 方法的准确度和精密度

分别设置低浓度、中浓度、高浓度3组试样，每组试样中分别加入一定量三聚氰胺标准溶液、三聚氰胺内标物，配制浓度分别为低浓度2 μg/kg、中浓度5 μg/kg和高浓度10 μg/kg这3组试样。低、中、高3组水平平行测定3次。以测定结果与理论加标量的比值表示加标回收率，以3次测定结果的SRSD值表示精密度，结果见表7。

表7 内标法测得的相对标准偏差 单位：%

结果表明，试验方法测定老酸奶、牛轧糖中三聚氰胺平均加标回收率在100.7%～104.5%之间，SRSD在0.3%～2.9%之间，表明该方法准确度高、平行性好，方法成熟、可靠。

3 结论

采用液质联用检测含乳型老酸奶、牛轧糖中三聚氰胺含量，因所选样品中含有大量胶基，无法直接提取所含三聚氰胺，因此试验优化样品中胶基溶解的方法，考察样品中的基质效应。比较外标法和内标法降低液质联用仪在检测中带来的基质效应影响，试验结果表明仅选用基质加标的方法无法彻底消除样品中的基质效应，基于此也无法获得准确的结果，试验选用内标法取得很好的效果。方法学验证表明，试验方法具有方法简便、灵敏度高、准确度好、稳定性强等特点，适用于对含乳型老酸奶、牛轧糖等含胶基食品中三聚氰胺的测定。