新型稀土荧光探针对ClO-的识别及其性能研究

代丽娜 张馨 张文月 张欣冉 崔希艳 张戈 张曼

摘 要：由于稀土离子具有优良的荧光特性，因此把稀土离子作为制备荧光探针的理想材料。论文制备的稀土荧光探针是以水合肼、荧光素钠、邻甲氧基苯甲醛、硝酸铕为原料，采用水热法进行合成。通过红外光谱仪、核磁共振、紫外等手段对稀土荧光探针进行表征，再通过荧光光谱测试稀土荧光探针形成稀土荧光配合物后作为荧光分子探针对ClO-的识别检测能力。结果表明，随着ClO-浓度增加，荧光值也随之增加，而探针本身不具有荧光，是与ClO-形成配合物后增强了其荧光值，可见稀土荧光探针对ClO-的识别能力很显著。通过与CO32-、CH3COO-、Cl-、SO42-、NO2-、NO3-进行比较可得出，合成的稀土荧光探针对次氯酸根表现出良好的专一选择性。

关键词：稀土荧光探针；水合肼；硝酸铕；次氯酸根

中图分类号：O614  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2023）09-0043-04

1 前言

次氯酸是含氧弱酸，多数情况下以次氯酸根离子形式存在，是重要的活性氧。在生物机体中，由于过氧化物酶的催化作用，次氯酸由氯离子和过氧化氢发生氧化还原反应而产生。在生物免疫系统中，HClO会凸显出强氧化性，而次氯酸盐含量的异常会引发心血管类疾病。因此大量学者展开了对次氯酸检测的研究[1]。

吴绵园以7-（4-甲氧基苯基）乙炔基香豆素为荧光基团，设计并合成了一种香豆素酰腙类荧光探针L，向该探针溶液（pH=7.4）中加入Cu2+，观察到颜色由黄色向浅棕色转变和明显的荧光猝灭效应[2]。该探针不受其他金属离子和阴离子的干扰，具有良好的抗干扰性、选择性以及较高的灵敏度。胡敏通过浸渍法将Eu3+封装在MOF-5孔道结构中，制备出一种新型Eu3+功能化MOF-5（Eu3+MOF-5）发光金属有机框架材料[3]。Eu3+MOF-5在394nm波长激发下表现出Eu3+特征荧光峰，在有机溶剂及水中具有良好的荧光稳定性，且显现对Fe3+的选择性和抗干扰能力良好。卢玉伟将4-溴-1，8-萘二甲酸酐作为原料，通过氨解、肼解等反应步骤合成了受体化合物L[4]。采用荧光滴定法研究了受体L与甲醛间的相互作用情况，结果表明，受体L表现出对甲醛较好的识别作用。通过核磁滴定实验验证了受体L与甲醛之间的作用机制，即L中的肼基（-NHNH2）与甲醛缩合形成腙，导致体系荧光增强[5]。刘艳玲以2，7-二溴-9-芬酮为原料，合成了一种新型的turn-on型ClO-荧光探针[6]。在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，逐渐滴加ClO-，使其浓度不断地增大，探针在511 nm位置的峰值也越来越大，呈绿色荧光发射。探针与ClO-反应迅速，10s内反应完成。细胞实验表明探针可以在细胞水平检测内源性和外源性的ClO-。姜亚男以活性氧（ROS）和活性氮（RNS）为原料，合成了一种含有喹唑啉酮骨架的腙型荧光探针（HEMQ），并通对其结构进行表征，结果表明，探针在pH值8～10范围内对ClO-具有良好的选择性和较好的灵敏度，并且响应十分快速。加入ClO-后，HEMQ溶液的颜色呈现从黄色到无色的变化，因而可以作为ClO-的裸眼探针[7]。

探针实现了裸眼识别目标离子。曹小燕以丹皮酚和糠醛为原料，识别基团作为丙烯酸酯，荧光团为黄酮醇，设计并合成了探针，采用核磁共振和高分辨质谱的方法证明其结构，结果显示，探针HFAC对半胱氨酸（Cys）具有高效的检测识别能力。同时，证实了探针是一种开关型荧光探针，荧光强度在525nm处与浓度在20-300μmol/L半胱氨酸范围内的呈现出良好的线性关系[8]。刘文芳用二乙基三胺五乙酸、钐稀土盐和杀草强为原材料[9]，设计并合成了新型稀土荧光探针SmⅢ-dtpaa-bis，该探针用于检测amitrole通过红外光谱对该荧光探针结构进行表征，再用荧光光谱及紫外可见光谱对该荧光探针光学性质进行分析研究，探究了反应时间、反应温度、溶液的酸碱度及杀草强浓度对该稀土荧光探针荧光光谱的影响[10]。姚飞以水溶态纳米Eu3+和TiO2为原料用液相法制备荧光探针，采用紫外吸收和荧光光谱研究了其发光性质和它与氯氰菊酯的相互作用，发现氯氰菊酯对荧光探针有猝灭作用。氯氰菊酯浓度与荧光探针荧光强度正相关，稀土铕荧光探针对氯氰菊酯检出限为2.5×10－11mol/L。用稀土铕荧光探针进行数据检测具有重现性和灵敏性好等特点[11]。黄蕊基于靶向线粒体的荧光HClO/ClO-探针继续开发具有远红外至近红外发射的HClO/ClO-探针。HClO/ClO-在线粒体中的分泌影响着细胞生理活动及病理活动。本文将探针检测根据不同类型的氧化反应进行归类总结，为开发更高效、更精准的HClO/ClO-探针提供帮助[12]。本文以水合肼、荧光素钠、邻甲氧基苯甲醛、硝酸铕为原料，采用滴定加入法合成了一种对次氯酸具有独特识别功能的新型荧光探针。

2 新型稀土荧光探针对ClO-的识别实验

2.1 实验试剂

荧光素；水合肼；乙腈；乙醚；液相色谱淋洗液；无水乙醇；邻甲氧基苯甲醛；硝酸铕；乙酸镁；次氯酸钙；碳酸镁；氯化亚铁；硝酸钡；硫酸镁。

2.2 實验仪器

超声波清洗机器（15-1729型），宁波新枝生物科技股份公司出品；台式高速离心机（DZF-6020AF），北京普析通用仪器公司出品；磁力加热搅拌器（Feb-78型），上海萃瑞生物科技有限公司出品；电热鼓风干燥箱（WRS-1B）郑州鑫涵仪器设备有限公司出品；循环水式真空泵（SHD-111），沈阳海普瑞仪器公司出品；傅里叶谱变换红外光谱仪Nicolet iS5型，北京普析通用仪器公司出品。

2.3 实验步骤

2.3.1 实验原理

稀土铕离子由于其体积小，易钻入探针内部，与氧离子结合形成稳定的环状结构。如图1和图2所示。

2.3.2 合成中间体荧光素肼

确保反应过程保持干燥状态，用分析天平称取7.8024g的荧光素钠，将荧光素钠与乙醇加入圆底烧瓶中混合均匀，搅拌并回流24h，并在回流过程中滴加水合肼10mL。反应结束，将圆底烧瓶冷却到室温，再进行减压抽滤，抽滤过程中要用少量的无水乙醇和乙醚分别洗涤产物两次。最后，将产物放置在真空干燥箱中，在80℃的温度下干燥产物约3h，得到荧光素肼白色中间体，计算产率约为62.81%。

2.3.3 制备稀土荧光探针

称取0.0756g荧光素肼，用50mL无水乙醇将其溶解，之后称取0.1662g的邻甲氧基苯甲醛，用10mL无水乙醇溶解，之后转移至100mL容量瓶中，配成10mol/L的邻甲氧基苯甲醛乙醇溶液。将上述溶液滴加到蒸馏烧瓶中，控制滴加的速率，在10min之内滴加完毕。称取0.872g硝酸铕加入烧杯中，上述实验操作需要恒温回流13h，回流结束，进行减压抽滤，期间使用少量的无水乙醇进行淋洗，所得产物在干燥箱中干燥8h后得到浅黄色的稀土荧光探针1.286g。

2.3.4 稀土荧光探针标准溶液的配制

称取稀土荧光探针0.1250g，用乙腈15mL把稀土荧光探针溶解后，再配制成浓度为5mmol/L的溶液，进行冷藏避光储存。测试使用时根据配比进行稀释配制成相应的溶液。

2.3.5 配制CO32-、SO42-、NO2-、NO3-、Cl-、CH3COO-的标准溶液

取含有CO32-、Cl-、NO3-、NO2-、SO42-、CH3COO-阴离子的盐，按照0.01mol对应的质量进行称量，将上述称量好的阴离子盐转移至100mL的小烧杯，加入蒸馏水配制相应浓度的溶液。

3 结果与讨论

3.1 对稀土荧光探针的红外光谱分析

采用溴化钾压片法，进行傅里叶变换红外光谱仪测试，对稀土荧光探针进行红外表征。

如图3所示，通过对荧光探针及稀土荧光探针进行红外光谱分析可知，从红外光谱图中可以看到合成的探针配合物在3430cm-1有峰，可以将此峰归属为酚羟基O-H单键，与纯荧光探针的酚羟基O-H单键相比较，发现稀土荧光探针的酚羟基O-H单键向高频进行了移动，即发生了红移。稀土荧光探针在1460cm-1处的峰是饱和甲基C-H单键峰，与纯荧光探针的饱和甲基C-H单键相比较，形成稀土荧光探针后，酰胺和饱和甲基都受到稀土铕离子的影响，因此合成的稀土荧光探针的饱和甲基C-H单键发生蓝移。同时也表明稀土荧光探针成功与铕发生配位，铕以离子的形式与探针1：3的配位形式存在。

3.2 荧光光谱法的研究结果

荧光光谱测试，随着加入的ClO-的浓度增加，荧光强度的相应变化线性关系是否明显。

由图4可以得出，向所制得的稀土荧光探针--Eu3+配合物中分别加入配制好的相同浓度的干扰阴离子CO32-、Cl-、CH3COO-、SO42-、NO3-、NO2-的标准溶液，其中，荧光探针固定浓度为2μmol/L。观察此表可以得知只有ClO-的加入使得稀土荧光探针--Eu3+配合物的荧光强度明显增强，而其他的阴离子荧光强度基本没有影响。这说明稀土荧光探针--Eu3+对ClO-具有良好的选择性。

3.3 荧光探针的紫外光谱分析

固定荧光探针溶液浓度为4μmol/L，分别配制浓度分别为1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L、5μmol/L、6μmol/L的次氯酸钙溶液。将光谱扫描范围坐标调为350～650nm，用紫外分光光度计分别测定以上6种不同浓度的溶液的吸光度，由此可以得出结论探针本身几乎无荧光，随着次氯酸根浓度的逐渐增加，吸光度逐渐增强，峰值逐渐增加。

3.4 探究不同pH值下稀土荧光探针的活性

结合图5得出，在强碱条件下，稀土荧光探针的表面增加了缺陷，使探针表面附着着较少部分掺杂离子，因此表面的发光离子易发生非辐射的能量损失，使得稀土荧光探针的发光效率大大降低。当溶液的pH值在5.00-8.00时，稀土荧光探针的荧光强度随着pH值的增加逐渐趋向于稳定：当溶液的pH>5.00时，稀土荧光探针的荧光强度逐渐增强，在溶液的pH=6.00时，稀土荧光探针识别ClO- 的荧光强度达到峰值。随后，随着pH值增大，稀土荧光探针的荧光强度会下降。由此得出结论，稀土荧光探针的最佳适用范围是pH=5.00-8.00。

4 讨论

本文用荧光素、邻甲氧基苯甲醛、水合肼、乙腈、硝酸铕为原料合成了稀土荧光探针。为使稀土荧光探针的高灵敏度呈现出分析价值，应用时间分辨荧光分析技术消除背景荧光的影响，从而合成具有选择性识别ClO-以及荧光响应功能的稀土荧光探针。对稀土荧光探针以及添加了不同浓度次氯酸根的稀土荧光探针用紫外—可见分光光度计与荧光分光光度计进行测定，可以得知，随着ClO-浓度增加，紫外吸收峰值也在增加，而探针本身不具有荧光，是与ClO-形成配合物后增强了荧光强度，可见稀土荧光探针对ClO-的识别能力很显著。为了检验稀土荧光探针对ClO-的识别性和选择性，分别加入NO3-、CH3COO-、Cl-、CO32-、NO2-、SO42-等干扰阴离子进行检验。结果表明，加入干扰阴离子后的稀土荧光探针荧光强度发生了微弱的变化，而加入ClO-的探针荧光强度明显增强，得出的结论是稀土荧光探针对ClO-的识别不受干扰阴离子的影响，稀土荧光探针对识别ClO-具有良好选择性与专一性。探究生物体与环境的酸碱性对该荧光探针应用的影响，探究pH对加入ClO-前后溶液的影响，荧光强度在pH=5-8的溶液中达到峰值。说明稀土荧光探针对ClO-的检测识别具有選择性、高灵敏度特点。

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参考文献：

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