产多酚氧化酶菌株在改善雪茄烟叶品质中的应用研究

潘 勇，吴巧茵，李林林，施友志，谭再钰，张 娟，王 剑

（1.湖北中烟工业有限责任公司，湖北 武汉 430040；2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；4.江南大学 未来食品科学中心，江苏 无锡 214122）

多酚是一类广泛存在于各种植物中的次生代谢产物，具有很强的抗氧化、抑菌、抗癌、治疗糖尿病等生物活性，多酚物质不仅可以通过抗紫外、抗虫起到保护植物的作用，对于雪茄烟叶的香气及劲头也具有重要影响[1-3]。烟叶中多酚类物质主要由绿原酸、芸香苷、莨菪葶及其转化产物组成，多酚类物质与蛋白质结合的产物沉淀使得口腔收敛、增加苦涩和干燥感，从而影响烟叶的感官质量[4]。多酚物质还与烟气浓度、劲头相关，多酚含量过高时烟气刺激性较大，苦涩感较强，含量过低使烟叶劲头不足[5]。如何协调雪茄烟叶发酵中多酚物质的含量，从而醇和烟叶香气、减少刺激性是雪茄生产中需要解决的问题。

目前，关于雪茄烟叶多酚物质的研究较少，且主要为晾制和发酵过程中多酚含量和多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性的变化。卢绍浩等[6]比较晾制过程中不同部位雪茄烟叶多酚物质含量发现，各部位绿原酸含量均呈下降趋势，PPO 活性呈先增后降的趋势。郭文龙等[7]研究发现，发酵过程多酚物质含量随发酵时间延长而降低，且多酚类物质与烟叶透发性、香气质、杂气、余味等显著相关。冯颖杰等[8]将1 株能够产生多酚氧化酶的鞘氨醇单胞菌应用于烤烟发酵后，能够增加烟叶香气质和香气量，回甜增加，提升烟叶感官质量。罗海涛等[9]将多酚氧化酶和木瓜蛋白酶复配后应用于再造烟叶梗膏发酵可使产物的吡啶、麦司明、苯甲醇等致香成分含量明显增加，能够增加烟气浓度、使烟气更柔和细腻。以上关于烟叶多酚物质的研究中尚缺乏对雪茄发酵中多酚物质的调控，尤其是产多酚氧化酶微生物在雪茄发酵中的应用研究。为此，通过特异性筛选获得多酚氧化酶的生产菌株，将其应用于雪茄发酵生产中，测定菌株对多酚物质氧化降解的影响，并对菌株改善烟叶品质进行机制解析，以期为国产雪茄烟叶原料品质改善提供新的技术方法，并为雪茄发酵过程中多酚含量及相关氧化酶活性的控制和工业生产微生物菌剂的生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 烟叶原料 发酵烟叶试验和发酵培养基中添加的烟叶原料为湖北来凤CX81 中部二级茄芯烟叶，及供试菌株均由湖北中烟工业有限责任公司提供。

1.1.2 主要试剂 绿原酸、邻苯二酚、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、CoCl2·6H2O 等，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器与设备 恒温振荡摇床（上海一恒科学仪器有限公司）、恒温培养箱（上海博讯实业有限公司）、恒温恒湿培养箱（上海博讯实业有限公司）、水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、紫外分光光度计［岛津仪器（苏州）有限公司］。

1.1.4 供试培养基 CGA 筛选平板：绿原酸2 g/L、Na2HPO4·12H2O 6.15 g/L、KH2PO41.52 g/L、（NH4）2SO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2·2H2O 0.05 g/L、微量元素溶液Ⅰ10 mL/L。微量元素溶液Ⅰ：EDTA 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素溶液Ⅱ100 mL/L。微量元素溶液Ⅱ：ZeSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、H3BO30.3 g/L、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuCl2·2H2O 0.01 g/L、NiCl2·6H2O 0.02 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.03 g/L。发酵培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L，烟叶粉末20 g/L。LB 培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L。LB 固体培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠10 g/L、琼脂15 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株筛选 本研究中使用CGA 筛选平板作为筛选培养基，以绿原酸为唯一碳源，烟叶微生物以无菌生理盐水为缓冲液，10 ℃、220 r/min 洗脱2 h，涂布菌悬液于CGA 筛选平板，于30 ℃/37 ℃静置培养，将筛选平板中生长的菌落即为能够降解绿原酸的菌株。将筛选获得的菌株在LB 培养基中重复划线，分离得到单菌落。

1.2.2 PPO 酶活性测定 将菌株接种发酵培养基，37 ℃、220 r/min 条件下发酵72 h，发酵液于4 ℃、7 000 r/min 离心，上清液即为粗酶液[以不加菌株的发酵液为对照（CK）]。酶活性测定参考文献[10]的方法，反应体系：0.1 mol/L pH 值6.0 的磷酸盐缓冲液3 mL，1 mL 浓度为0.1 mol/L 邻苯二酚溶液以及0.2 mL 粗酶液，混合均匀于37 ℃反应30 min 后测定OD460。以0 min时的反应体系作为空白对照。

式中：V为反应体系内粗酶液的体积（mL）；ΔOD460为吸光度值的变化值；ΔT为反应时间（min）。PPO 活性定义：1 mL 酶液在1 min 内使得吸光度值变化0.001定义为1个酶活性单位（U/mL）。

1.2.3 菌种鉴定 以16S rDNA 序列分析鉴定筛选的菌株。以该菌株的基因组为模板，引物分别为27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），PCR 反 应 程序：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35 个循环；最终72 ℃终延伸10 min。扩增的PCR 产物经纯化和回收后，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI数据库中进行比对。

1.2.4 烟叶发酵 以湖北中烟工业有限责任公司的湖北省来凤县CX81 中部二级烟叶为样品，取200 g 烟叶装在自封袋中，菌株以2%接种量均匀喷洒到烟叶表面并使得烟叶最终含水量为28%，室温回潮12 h后于37 ℃、湿度为70%恒温恒湿培养箱中发酵15 d。以添加相同体积无菌水的烟叶作为对照，标记为CK。将发酵结束的烟叶卷制成烟支，使用真空回潮机平衡烟支水分并去除杂气，待进行感官质量分析。

1.2.5 烟叶感官质量分析 发酵烟叶的感官质量分析由湖北中烟工业有限责任公司进行，按照1～5分对样品的香韵、定性指标和定量指标进行打分，不存在记0 分。香韵分为：木香、豆香、花香、蜜甜香、醇甜香、焦甜香、清甜香、花粉香、奶香、干草香、烘焙香、树脂香、果香、药草香、坚果味、皮革味、咖啡味、胡椒味。定性指标分为苦、甜、咸、辣、涩，定量指标分为烟气浓度、烟气强度、透发性、醇和度、雪茄风格彰显度、香气质、香气量、杂气、刺激性、余味、甜润感、燃烧性、灰色。

1.2.6 感官质量得分计算 烟叶感官质量按照公式进行计算，主要由香气质、香气量、杂气、刺激性、余味、甜润感、燃烧性和灰分8 项指标综合计算得出，各项指标权重分别为18%、16%、10%、12%、16%、10%、10%和8%。质量得分=（香气质×18%+香气量×16%+杂气×10%+刺激性×12%+余味×16%+甜润感×10%+燃烧性×10%+灰分×8%）/各项指标最大分值之和×100，质量得分结果保留2位小数。

1.2.7 烟叶挥发性化合物测定 使用DB-5MS色谱柱，萃取头为SPME 纤维，氦气流速恒定为1.0 mL/min。测定程序：进样开始时，柱温为40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 的 速 率 升 温 至250 ℃，保 持5 min。离子源温度为210 ℃，传输线温度为280 ℃。系统运行模式为EI 模式，EI 电压为70 eV[11]。以全扫描模式在33～400 m/z 的质量扫描范围扫描，采集速率为每秒扫描10 次。以计算机谱库WILEY 8.0和NIST14 库比对分析，选择相似度在800 以上且具有香韵特征的挥发性化合物进行分析，相对含量计算采用面积归一法。

2 结果与分析

2.1 产多酚氧化酶菌株的特异性筛选

利用CGA 筛选平板通过特异性筛选获得3 株能够降解绿原酸的菌株，将3 株形态不同的菌株分别命名为C1、C2和C3。如图1所示，其中C1菌株菌落表面有褶皱、白色，典型的芽孢杆菌形态；C2菌株菌落呈黄绿色，表面光滑；C3菌株菌落呈浅黄色，表面光滑。经过平板划线纯化后进行菌种鉴定，通过NCBI 数据库比对，C1 菌株与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度为99.72%，C2 菌株 与 副 凝 聚 小 短 杆 菌（Brachybacteriumparaconglomeratum）相似度为99.74%，C3 菌株与鸟短杆菌（Brevibacterium avium）相似度为99.79%。

图1 产多酚氧化酶菌株平板菌落形态Fig.1 Colony morphology of PPO producing strains

将纯化后的菌株接种于发酵培养基中，发酵72 h 测定PPO 酶活性，结果如图2 所示，筛选到的3株菌株都具有产PPO 的能力，其中菌株C3 发酵液PPO 酶活性最高，达到141.67 U/mL；菌株C2 发酵液中PPO酶活性最低，为41.67 U/mL。

图2 菌株发酵产多酚氧化酶活性Fig.2 Activity of polyphenol oxidase produced by strain fermentation

2.2 产多酚氧化酶菌株发酵烟叶感官质量分析

将菌株发酵液接种于烟叶表面，发酵15 d 后进行感官质量分析，结果如图3所示。烟叶原料CX81有刺激性，香气质中等、香气量一般，3 株产多酚氧化酶菌株C1、C2、C3 发酵烟叶质量得分分别为59.35、63.90、57.70 分，较CK 分别增加4.10、8.65、2.45 分。产多酚氧化酶菌株应用于发酵，烟叶香气透发性、甜润感、灰色、余味等感官指标提升，烟叶香韵类型增加、香气质和香气量改善。菌株C1发酵后木香突出，树脂香、豆香、清甜香、花粉香等6种香韵增加；菌株C3发酵后蜜甜香较突出，坚果香、清甜香、花粉香、豆香4种香韵增强；菌株C2发酵后木香香韵突出，坚果味、烘焙香、豆香、清甜香、干草香、蜜甜香等7 种香韵增强。与菌株C1、C3 相比，菌株C2发酵烟叶香气质、香气量、透发性、余味等指标改善最为明显，香韵类型最丰富，应用于雪茄烟叶发酵中感官质量整体表现较好，烟叶工业可用性提升。

图3 产多酚氧化酶菌株发酵烟叶感官质量雷达图Fig.3 Radar chart of smoking quanlity of PPO producing strains fermented cigar leaves

2.3 产多酚氧化酶菌株发酵烟叶挥发性化合物变化分析

经烟叶挥发性化合物检测，发现3 株产多酚氧化酶发酵菌株应用于雪茄烟叶能够增加烟叶美拉德反应产物、芳香族氨基酸降解产物、脂肪酸降解产物和烟碱降解产物含量，结果如图4所示。与CK相比，菌株C1发酵烟叶中苯乙酸乙酯、二氢大马酮、新植二烯与壬酸乙酯、月桂醇等脂肪酸降解产物增加；菌株C2 发酵烟叶中2，6-二甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪等美拉德反应产物和乙酸乙酯含量明显增加；菌株C3 发酵烟叶中苯甲醇、苯甲醛等芳香族氨基酸降解产物和法尼醇、六氢假紫罗酮、甲基庚烯酮等类胡萝卜素降解产物含量增加。

图4 产多酚氧化酶菌株发酵烟叶挥发性化合物热图Fig.4 Heatmap of volatile compounds of PPO producing strains fermented cigar leaves

产多酚氧化酶菌株在烟叶中发酵产PPO 将绿原酸降解生成咖啡酸和奎尼酸等中间产物，咖啡酸氧化降解进一步与氨基酸等发生美拉德反应，生成吡嗪、吡啶、2-甲基吡嗪等杂环化合物；奎尼酸经过脱水、脱氢等酶促反应生成莽草酸，莽草酸作为合成芳香族氨基酸、脂肪酸等多种香气物质的重要前体物质，能够合成苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在脱氨酶等酶系催化下促使苯乙醇、苯乙醛等苯丙氨酸降解产物生成（图5）。

图5 美拉德反应产物和芳香族氨基酸降解产物预测代谢途径Fig.5 Predicted metabolic pathways of MRs and AADV

3 结论与讨论

调控多酚物质的含量主要通过品种选育、栽培措施和调控PPO 活性等手段，对于自身质量较差的烟叶主要利用控制温度、pH值等环境因素和添加氮钾肥料、醌类偶联剂抑制多酚物质降解[12-14]，合理调控多酚含量从而提升雪茄烟叶品质是目前重要的研究方向。郝贤伟等[15]的研究结果表明，绿原酸含量高于15 mg/g、莨菪亭含量低于0.2 mg/g 时，烟叶感官质量指标得分较高。卢绍浩等[16]的研究结果表明，多酚含量与烟叶品质呈正相关关系，但多酚与蛋白质氧化成醌类物质后，不仅影响烟叶口感还会使烟叶颜色过深。

本研究通过分析产多酚氧化酶菌株在雪茄发酵中对烟叶挥发性化合物和感官质量的影响，发现多酚氧化酶生产菌株能够增加雪茄烟叶香韵、减轻烟叶刺激性、提升烟叶品质和工业可用性，与ZHAO等[5]通过增加烟叶PPO 活性使绿原酸含量降低85.32%，且雪茄生产烟叶质量得到明显提高的结果相似。分析挥发性化合物变化发现，发酵烟叶中美拉德反应产物、脂肪酸降解产物、芳香族氨基酸降解产物和类胡萝卜素降解产物含量增加。多酚类物质代谢转化生产咖啡酸和奎尼酸，分别作为美拉德反应产物和芳香族氨基酸、脂肪酸前体物质，与陈园等[17]、杨博等[18]的研究结果一致。乙酸乙酯主要由微生物代谢生成，随着多酚类物质的氧化降解减少了对微生物的代谢使乙酸乙酯含量增加，与LIU 等[19]的研究结果一致。可见，产多酚氧化酶菌株通过氧化降解调控了雪茄烟叶多酚物质转化，增加了美拉德反应产物、芳香族氨基酸降解产物和脂肪酸降解产物的含量，可作为雪茄工业发酵微生物菌剂，应用于低等级烟叶品质提升。

通过特异性筛选获得3 株可降解绿原酸菌株C1、C2、C3，与对照相比，菌株C1发酵烟叶中壬酸乙酯、月桂醇等脂肪酸降解产物增加，壬酸乙酯、苯乙酸乙酯具有甜香、花果香等香味，使烟叶清甜香和花粉香增强；菌株C2 发酵烟叶中2，6-二甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪等美拉德反应产物和乙酸乙酯含量增加，分别具有烘焙香、坚果味和甜香，与烟叶烘焙香、清甜香提升结果一致；菌株C3 发酵烟叶中苯甲醇、苯甲醛、法尼醇、甲基庚烯酮等分别有清香、干草香、花香和清甜香等香味，其含量增加与烟叶清甜香、香韵提升结果一致[20-22]。菌株C3 发酵烟叶中类胡萝卜素降解产物含量增加，推测可能是因为PPO活性与绿原酸和质体色素呈正相关的关系[6]。

本研究将产多酚氧化酶菌株接种于雪茄烟叶发酵，增加了烟叶挥发性化合物含量，降低了烟叶刺激性并明显改善了烟叶品质，有利于进一步实现多酚氧化酶酶制剂、微生物菌剂在雪茄发酵中的开发应用，促进了多酚及相关氧化酶对雪茄品质影响的机制研究。本研究筛选出的C1、C2、C3 菌株对烟叶挥发性化合物和香韵特征影响不同，后续的研究可将菌株C1、C2、C3 分别作为清甜香、烘焙香和坚果味特征香韵的功能微生物，通过发酵条件优化进一步提升雪茄香韵。