不同基因型甘薯叶片酚类质量分数及PPO，POD活性的差异

冉海榕， 李佳欣， 傅玉凡， 陈培涛，王璐璐， 黄雨， 宗继锴， 罗青青

西南大学 生命科学学院/重庆市甘薯工程技术研究中心，重庆 400715

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是我国重要的粮食、 饲料和工业原料作物之一[1]． 随着淀粉甘薯、 鲜食甘薯产业规模化和专业化的发展, 块根成为主要的收获对象, 而原先被作为饲料利用的藤蔓则被大量遗弃[2], 造成资源浪费、 病虫害传播． 甘薯藤蔓含有丰富的蛋白质、 维生素和矿物质以及多酚、 绿原酸等功能性物质[3-4], 不仅是营养丰富的饲料和叶类蔬菜来源, 还具有预防心血管等疾病、 提高人体免疫力等多种生理保健功能[5-6], 值得重视和开发利用, 如从甘薯品种渝紫薯7号、 西蒙1号中成功提取、 纯化出多酚[7]和制作饮料冲剂等[8]． 酚类物质普遍存在于植物中, 在植物生长发育、 繁殖以及抗逆等过程中发挥着重要作用[9], 但容易被多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)和过氧化物酶(peroxidase, POD)氧化成醌类物质从而降低果蔬等农产品的营养成分和商品品质, 造成经济损失[10], 其合成与积累与PPO, POD的生理活性具有一定的相关性[11]． 除此之外, PPO, POD在乙醇生产、 啤酒风味陈化等食品加工、 污水处理等领域也具有重要的利用价值[12-13]．

就甘薯叶片中功能成分而言, 前人的研究多集中在酚类、 绿原酸、 黄酮等质量分数和组分的定性定量分析[14-15]、 抗氧化能力[16-17]等方面, 由于检测方式、 实验材料及其栽培因素的差异, 相关的研究结论具有一定的差异． 关于甘薯PPO, POD活性的研究也往往只针对于块根, 如鲜切甘薯不同部位褐变机理差异[18-19]、 不同处理对酶活性的影响[20]等方面, 而甘薯叶片中关于这两种酶的研究较少, 且只在少数品种中开展过两种酶的分离纯化与性质研究[[13, 21]． 由于叶片是藤蔓的主要部位, 其质量占比在50%以上[22], 有资料显示多酚质量分数有器官依赖性[23], 且质量分数与绿原酸质量分数呈正相关[24], 因此, 本文对86个甘薯高级育种品系叶片中多酚、 绿原酸的质量分数、 抗氧化能力、 PPO和POD活性进行测定和分析, 以期为这些甘薯新品系的进一步鉴定、 藤蔓资源的利用提供一定的数据支撑, 也为PPO, POD的进一步研究奠定基础．

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的86个甘薯新品系或基因型, 均来自于重庆市甘薯工程技术研究中心合川农场基地2020年的品种比较试验． 供试材料的编号、 名称见表1．

表1 86个供试甘薯的编号、 名称

1.2 田间试验设计

采用随机区组排列小区, 重复3次, 小区面积20 m2, 种植密度60 000株/hm2． 试验于2019年5月17日至6月20日栽插, 常规性施肥、 中耕、 除草等田间管理．

1.3 取样及其样品制备

生长期110 d时在品种比较试验的Ⅱ重复里取样． 藤蔓自上往下第3～4节位采集新鲜无病斑、 无腐烂的叶片, 质量约100 g, 快速去除杂质、 切丝、 混匀后装入纸袋, 置于电热恒温鼓风干燥箱于 40 ℃干燥至恒质量． 烘干的样品用中草药植物粉碎机粉碎, 过100目筛后、 密封低温保存, 用于多酚、 绿原酸质量分数测定及ABTS自由基清除能力测定．

每个供试材料再随机挑选3株藤蔓, 取其自上往下第3～4节位新鲜无病斑、 无腐烂的叶片, 快速去除杂质后称质量, 锡箔纸包住液氮处理后-80 ℃保存, 用于PPO, POD活性测定．

取样均重复3次．

1.4 总多酚提取与测定

标准曲线的制作: 参照张文婷等[14]的方法得到没食子酸浓度(X)与吸光度(Y)的回归方程:

Y=2.852 7X+ 0.054R2=0.999 0

样液制备: 参照Sun等[5]的方法, 稍作修改． 准确称取0.200 0 g粉末干样, 加入70%乙醇8.0 mL, 浸泡提取16～18 h后, 超声30 min, 5 000 r/min离心15 min, 吸上清液于50 mL离心管中, 向残渣中加入70%乙醇8.0 mL 再次提取, 合并2次提取液, 于55 ℃条件下旋蒸, 用蒸馏水洗涤浓缩液, 定容, 得到总多酚提取待测液．

质量分数测定: 取0.20 mL待测液, 按照标准曲线的方法测定待测液吸光度． 总多酚质量分数表示为每克鲜质量的没食子酸当量(gallic acid equivalent, GAE)毫克数, 计算公式为

C总多酚=(A×V1)/m×B

式中,C总多酚为总多酚的质量分数(mg/g);A为反应体系样液浓度(mg/mL), 由标准曲线回归方程计算可得;V1为定容体积50 mL;m为称取的粉末干样0.200 0 g;B为叶片干物质质量分数(%)．

1.5 绿原酸的提取与测定

标准曲线的制作: 参照傅玉凡等[17]的方法得到绿原酸浓度(X)与吸光度(Y)的回归方程:

Y=0.028 7X-0.003 7R2=0.999 0

样液制备: 参照傅玉凡等[17]的方法, 稍作修改． 准确称取0.200 0 g粉末干样, 加入50%乙醇20.0 mL, 浸泡提取20 h后, 超声30 min, 5 000 r/min离心20 min, 吸上清液于50 mL离心管中, 向残渣中加入 50%乙醇20.0 mL再次提取, 合并2次提取液, 定容得绿原酸待测液．

质量分数测定: 待测液稀释20倍后, 在326 nm处测定待测液吸光度． 绿原酸质量分数表示为每克鲜质量的绿原酸当量(chlorogenic acid equivalent, CAE)毫克数, 计算公式为

C绿原酸=(A×n×V2)/(m×1 000)×B

式中,C绿原酸为绿原酸的质量分数(mg/g);n为稀释倍数20;V2为定容体积50 mL．

1.6 ABTS自由基清除能力测定

样品醇溶提取液的制备: 参照1.5方法制备4.0 mg/mL的醇溶提取样液．

ABTS自由基储备液的制备: 参照Re等[25]的方法． 计算使ABTS自由基活性降低50%的提取液浓度后, 换算成鲜基下的半数效应浓度(EC50), 分析EC50与鲜基下的总多酚和绿原酸质量分数以及PPO, POD活性的相关性．

S=[(A0-A1)/A0]×100

式中,S为ABTS自由基清除率(%),A0,A1为反应前后的吸光度．

1.7 PPO, POD活性测定

粗酶液提取: 参照李娇洋[26]方法．

PPO活性的测定: 参照梁建荣[21]的方法并稍加修改． 反应体系为2.0 mL磷酸缓冲液, 加入1.6 mL邻苯二酚, 再加入200 μL粗酶液, 于401 nm处比色测定, 用蒸馏水作为对照, 以每分钟吸光度变化0.01为1个PPO活性单位(U/g·min)．

POD活性的测定: 参照付伟丽等[13]的方法并稍加修改． 反应体系为2.775 mL磷酸缓冲液, 加入0.1 mL愈创木酚, 0.1 mL H2O2, 再加入25 μL粗酶液, 于470 nm处比色测定, 用蒸馏水作为对照, 以每分钟吸光度变化0.01为1个POD活性单位(U/g·min)．

1.8 数据处理

数据的整理、 计算用软件 Excel 2019, 数据的相关性分析以及方差分析采用SPSS 26.0．

2 结果与分析

2.1 供试材料的分组

86个基因型有5组叶片色泽的品种群体(BC), 即BC1(紫绿), BC2(深绿), BC3(褐绿), BC4(绿), BC5(浅绿)． 根据叶片干物质质量分数测定得到的数据, 可将86个品种分为8组干物质质量分数基因型群体(DM)． 86个基因型在BC, DM中的分布见表2．

表2 86个甘薯基因型在叶片色泽和干物质质量分数群体上的分布

2.2 叶片干物质、 总多酚和绿原酸的质量分数、 EC50以及PPO, POD活性的多重比较

2.2.1 86个基因型间的比较

叶片干物质、 总多酚和绿原酸的质量分数等6项指标在86个基因型间的变幅、 平均值和变异系数如表3． 方差分析表明鲜基叶片的这6项指标在86个基因型间均有统计学意义．

表3 86个甘薯基因型6项指标的平均值、 变幅和变异系数

2.2.2 BC群体内不同基因型间和BC群体间的比较

叶片干物质、 总多酚与绿原酸的质量分数等6项指标在同一BC群体内部不同基因型之间的变幅、 平均值、 变异系数见表4．

干物质质量分数指标在群体内的变异系数相对较小, 而总多酚与绿原酸质量分数以及EC50指标变异系数居中, PPO, POD活性在BC群体内变异系数最大． 多重比较表明, 无论哪一个BC群体, 6项指标在群体内不同基因型间差异均有统计学意义(数据略)．

除POD活性外, 其余5项指标在BC群体间差异无统计学意义． BC1群体的POD活性显著高于BC2群体和极显著高于其余BC群体． POD活性在BC2-BC5群体间差异无统计学意义．

2.2.3 DM群体内不同基因型间和DM群体之间的比较

叶片干物质、 总多酚与绿原酸的质量分数等6项指标在同一DM群体内不同基因型之间的变幅、 平均值、 变异系数见表5．

DM群体内不同基因型间的叶片干物质、 总多酚与绿原酸的质量分数、EC50的变异系数普遍低于DM群体间的变异系数, 而PPO活性和POD活性的变异系数普遍高于DM群体间的变异系数． 叶片干物质、 总多酚与绿原酸的质量分数、EC50值以及PPO, POD活性6项指标在DM群体间的变异系数均高于BC群体间的变异系数． DM群体内不同基因型间比较表明, 叶片干物质、 总多酚和绿原酸的质量分数以及EC50差异无统计学意义, 而PPO, POD活性在群体内基因型间差异有统计学意义(数据略)．

叶片干物质质量分数在两两DM群体之间差异有统计学意义． DM8的总多酚与绿原酸质量分数均显著高于其他群体, DM1与DM2之间的总多酚、 绿原酸质量分数差异无统计学意义, 但都显著低于其他群体． DM1的EC50显著高于其他群体, DM5至DM8群体之间的EC50差异无统计学意义, 但都显著低于其他群体． DM1群体的PPO活性最大, 与DM5的PPO活性差异有统计学意义, 与其他DM群体之间差异无统计学意义． POD活性在8个DM群体之间差异无统计学意义．

2.3 相关性分析

2.3.1 总多酚质量分数与干物质和绿原酸质量分数、EC50的相关性

总多酚质量分数与干物质和绿原酸的质量分数、EC50的相关性如表6(群体内不同基因型之间相关性不明显, 相关系数未列出)． 在86个基因型之间、 DM群体间的分析尺度上, 总多酚质量分数与干物质质量分数、 绿原酸质量分数均呈极显著正相关, 与EC50呈极显著负相关; BC群体之间, 总多酚质量分数与干物质质量分数呈极显著正相关, 与绿原酸质量分数呈显著正相关, 与EC50呈负相关． BC2, BC3, BC4, BC5群体内不同基因型之间的总多酚与干物质质量分数、 绿原酸质量分数呈显著或极显著正相关, 与EC50(除BC3外)呈极显著负相关． DM群体内不同基因型之间, 总多酚质量分数与干物质质量分数相关性不明显, 与绿原酸质量分数只在DM1和DM4群体内不同基因型之间呈显著或极显著相关性, 与EC50只在DM1和DM8群体内不同基因型之间呈显著负相关, 而在DM6群体内不同基因型之间呈显著正相关．

表6 总多酚质量分数与干物质和绿原酸质量分数、 EC50的相关性

2.3.2 绿原酸质量分数与干物质和总多酚质量分数、EC50的相关性

绿原酸质量分数与干物质和总多酚质量分数、EC50的相关性的趋势类似表6(具体数据略)． 在86个基因型之间、 BC群体间、 DM群体间的分析尺度上, 绿原酸质量分数与干物质和总多酚的质量分数呈显著或极显著关系, 与EC50只在86个基因型之间和DM群体间呈显著或极显著负相关． BC群体内不同基因型之间, 除绿原酸质量分数与总多酚质量分数、EC50在BC1群体内相关性不明显外, 其余情况下绿原酸质量分数与干物质和总多酚质量分数呈显著或极显著正相关, 与EC50呈显著或极显著负相关． 绿原酸质量分数与干物质质量分数只在DM1,DM2和DM5群体内不同基因型之间呈显著或极显著正相关, 与总多酚质量分数只在DM1和DM4群体内不同基因型之间呈显著或极显著正相关, 与EC50只在DM4群体内不同基因型之间呈显著负相关．

2.3.3 PPO, POD活性之间及其与干物质、 总多酚与绿原酸质量分数、EC50的相关性

86个基因型之间、 BC4和DM1群体内不同基因型之间的分析尺度上, PPO活性与POD活性呈显著负相关, 其余分析尺度下, PPO活性和POD活性之间没有显著的相关性． PPO活性与干物质质量分数只在DM1群体内不同基因型之间呈极显著负相关, 与总多酚质量分数只在DM1和DM4群体内不同基因型之间呈显著负相关, 与绿原酸质量分数只在DM1群体内不同基因型之间呈显著负相关． POD活性与干物质质量分数只在DM3群体内不同基因型之间呈显著正相关, 与绿原酸质量分数只在DM7群体内不同基因型之间呈极显著负相关． PPO, POD活性与EC50在各种分析尺度下相关性均不明显．

3 讨论与结论

本文以甘薯藤蔓主要器官叶片为研究对象, 测定其干物质、 总多酚和绿原酸质量分数, 结果表明在86个基因型之间差异有统计学意义． 这与Sun等[5]、 王永徐[27]的研究结果相类似, 表明可以通过育种手段筛选出叶片总多酚、 绿原酸高质量分数的甘薯专用基因型; 也说明在多个淀粉基因型或多个鲜食甘薯基因型相当的情况下, 可以优先选用叶片总多酚、 绿原酸高的基因型, 便于综合利用．

总多酚和绿原酸质量分数虽然在BC群体间差异无统计学意义, 但在深绿(BC2)或浅绿(BC5)群体叶片里变异系数较大, 且变幅的上限值相对较高． 总多酚和绿原酸质量分数在DM群体内不同基因型之间差异较小, 但在DM群体间差异有统计学意义, 且与杜晓华等[28]的研究结果相类似． 总多酚、 绿原酸质量分数在86个基因型之间、 BC群体间、 DM群体间以及BC群体内不同基因型之间多个分析尺度下均与相应的叶片干物质质量分数呈显著或极显著正相关性． 同时与梨果实[29]、 红树莓叶[30]、 黑核桃青皮[31]、 番石榴果实[32]等研究中的总多酚质量分数与抗氧化活性呈显著的正相关相类似． 甘薯叶片醇溶提取液的ABTS自由基清除能力与其总多酚和绿原酸的质量分数呈显著或极显著正相关, 因此, 可以在深绿(BC2)或浅绿(BC5)群体里筛选叶片总多酚和绿原酸质量分数较高的功能性基因型, 并以叶片干物质质量分数为间接筛选指标． 就本文供试材料而言, 综合考虑总多酚和绿原酸的质量分数以及ABTS自由基清除能力的EC50值, 编号50(BC5DM8群体里的15-10-2), 33(BC5DM7群体里的T85-5), 18(BC2DM8群体里的18-10-3)等可作为总多酚、 绿原酸功能成分育种资源或进一步鉴定筛选, 如15-10-2是一个薯块食味好的品系, 而18-10-3是一个薯块淀粉质量分数较高的品系． 值得注意的是83号18-6-24, 79号广薯72叶片总多酚、 绿原酸质量分数相对不高, 但是其EC50值相对较低, 抗氧化活性较高, 可能与其总多酚、 绿原酸的组分种类有关系[33], 值得进一步研究．

本文86个基因型叶片之间的PPO, POD活性变幅较宽, 变异系数较大, 高低相差约35倍, PPO和POD活性与叶片色泽、 干物质质量分数以及总多酚和绿原酸质量分数仅在部分群体内有相关性, 且没有明显规律可循． 这可能与PPO, POD活性与遗传、 植物代谢和环境等因素的关系较为复杂有关[34], 如植物酚类物质代谢途径涉及到酶的种类繁多, 有时并不只与PPO, POD两个酶[35]有关, 而且POD, PPO除了能够将酚类物质氧化成醌类物质外, 还参与了木质素前体的聚合作用[36-37]． 本文中编号17(18-11-7), 43(18-1-1), 46(171404)的PPO活性相对较高, 编号5(161010), 10(161834), 84(18-6-1)的POD活性相对较高, 可进一步提取分离纯化[13, 21]或作为种质资源在甘薯育种中加以利用．