CBX4 基因rs1285251 位点单核苷酸多态性与子宫肌瘤的关系研究

陆美茵 朱东艳 光晓燕 李剑

子宫肌瘤是女性生殖系统最常见的肿瘤, 好发于30～50 岁女性, 发病率高达33%［1］, 但其确切的病因尚未阐明。已有研究提示, 子宫肌瘤具有遗传易感性, 其发病与特定基因的多态性密切相关, 如雌激素代谢通路基因COMT、SULT1A 以及DNA 损伤修复与细胞增殖基因XPC、XRCC1［2-5］。从遗传学层面揭示子宫肌瘤的易感因素, 对该疾病的早期筛查、治疗抉择及预后监测无疑具有重要意义。色素框同源蛋白4(chromobox protein homolog 4, CBX4) 隶 属 多 梳 蛋 白 家族(polycomb-group proteins, PcG), 是多梳抑制复合物1(poly-comb repressive complex 1, PRC1)的 重 要 组 成 蛋白［6］。CBX4 通过对H3K9me3、H3K27me3 等染色体组蛋白的泛素化修饰, 促进染色体重塑而抑制下游基因转录, 以此调控DNA 修复、细胞增殖、分化及衰老等生理或病理机能［7-9］。既往研究表明, CBX4 基因多态性与多种肿瘤发病风险或预后相关。Tan 等［10］报道该基因rs2289728 位点GA 基因型携带者罹患肝细胞肝癌的风险显著升高, Luo 等［11］发现其rs77447679 位点CA 基因型是胃癌的易感因素。作者在子宫肌瘤易感基因筛查工作中, 发现CBX4 基因rs1285251 位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与子宫肌瘤发病及临床病理特征间关系密切, 该位点有望成为子宫肌瘤风险预测的新靶标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014 年2 月～2020 年1 月在深圳市宝安区妇幼保健院就诊的子宫肌瘤患者419 例作为病例组, 所有患者均通过术后组织病理学确诊为子宫平滑肌瘤, 年龄21～49 岁, 平均年龄(36.1±7.5)岁。选取同期在本院体检的499 例健康女性作为对照组,经B 超检查排除子宫肌瘤, 年龄23～50 岁, 平均年龄(36.7±8.8)岁。两组研究对象的一般资料比较, 差异无统计学意义(P＞0.05), 具有可比性。两组研究对象均为汉族, 均排除了恶性肿瘤、其他女性生殖系统疾病、内分泌疾病且近半年内无激素类药物治疗史。研究获得宝安区妇幼保健院医学伦理委员会批准, 入组者均签署研究知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA 提取 EDTA 采血管采集两组研

究对象2 ml 肘静脉外周血, 置于-20℃冰箱保存。使用MagaBio plus 全血基因组DNA 纯化试剂盒(杭州博日科技股份有限公司)抽提DNA, 紫外分光光度计检测DNA 浓度及纯度, 操作严格按照试剂说明书进行。

1.2.2 基因分型 利用NCBI dbSNP 数据库和SNPinfo数据库, 以汉族女性人群最小等位基因频率＞5%为检索条件, 查询CBX4 基因位点的SNP。本研究选择其中的rs1285251(IVS2 C＞T)位点为研究对象。采用MassARRAY (Agena Bioscience 公 司, 美 国) 方 法予CBX4 基因SNP 分型检测［12］：①样本DNA 行聚合酶链式反应(PCR)扩增。反应总体积5 μl, 反应条件94℃ 4 min, 94℃ 20 s, 56℃ 30 s, 72℃ 1 min, 45 个循环, 72℃ 3 min。②虾碱性磷酸酶去除体系中游离dNTPs。③单碱基延伸, 反应总体积9 μl, 反应条件94℃ 4 min, 94℃ 5 s, 52℃ 5 s, 72℃ 5 s, 40 个循环。④MassARRAY Nanodispenser RS1000 点 样 仪, 将 延伸产物移至SpectroCHIP (Agena)芯片。⑤基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析芯片数据, TYPER 4.0 软件予结果分型。扩增引物序列为5'-ACGTTGG ATGCCACTTTGCTTCGCACAGAG-3', 5'-ACGTTGGA TGTCAGGAGGCAGAAGCTCAG-3'。延伸引物序列为5'-CACCTCTGGCCCTCC-3'。

1.3 统计学方法 采用SPSS27.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t 检验；遗传平衡分析采用Hardy-Weinberg 平衡检验；基因型频率及等位基因频率以率(%)表示, 采用χ2检验；单变量和多变量Logistic 回归计算相对优势比(odd ratio, OR)与95%可信区间(confidence interval,CI)。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Hardy-Weinberg 平衡检验结果 病例组和对照组CBX4 基因rs1285251 位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(χ2=2.110、3.205, P=0.146、0.073＞0.05)。结果提示纳入的研究对象具有群体代表性。见表1。

2.2 两组基因型频率及等位基因频率分布比较 病例组与对照组CBX4 基因rs1285251 位点基因型频率及等位基因频率分布比较, 差异均具有统计学意义(P＜0.05)。病例组人群TT 基因型较对照组人群更为常见(占比依次为12.17%、6.41%), 等位基因T 频率亦显著高于对照组(占比依次为32.58%、28.36%)。见表2。

2.3 CBX4 基因多态性与子宫肌瘤发病风险的关系与CC基因型相比, 携带TT基因型人群子宫肌瘤发病风险明显升高［OR=2.046, 95%CI=(1.268, 3.301), P=0.003＜0.05］, 校正年龄后仍有统计学差异［OR=1.951,95%CI=(1.138, 3.344), P=0.015＜0.05］。再 对 该 位 点 显性与隐性模型进行分析, 结果显示隐性模型条件下,TT 基因型携带者与TC+CC 基因型相比罹患子宫肌瘤的风险更高［OR=2.023, 95%CI=(1.273, 3.212), P=0.003＜0.05］, 校正年龄后仍有统计学差异 ［OR=2.018,95%CI=(1.201, 3.393), P=0.008＜0.05］。显性模型条件下各基因型与子宫肌瘤发病风险无关(P＞0.05)。见表3。

2.4 CBX4 基因多态性与子宫肌瘤临床病理特征的分层分析 进一步评价了隐性模型条件下, CBX4 基因多态性与子宫肌瘤临床病理特征间的关联度。分层分析显示, 携带TT 基因型的＜40 岁女性子宫肌瘤患 病 风 险 明 显 升 高［OR=1.811, 95%CI=(1.054, 3.110),P=0.031＜0.05］, 校正年龄后仍有统计学差异［OR=1.839,95%CI=(1.036, 3.264), P=0.037＜0.05］；但TT 基因型并未影响≥40 岁女性罹患肌瘤的风险。此外, TT 基因型携带者出现多发性肌瘤［OR=2.432, 95%CI=(1.406,4.209), P=0.001＜0.05］、校正年龄后仍有统计学差异［OR=2.726, 95%CI=(1.438, 5.167), P=0.002＜0.05］, 肌壁 间 肌 瘤［OR=2.145, 95%CI=(1.320, 3.485), P=0.002＜0.05］、校正年龄后仍有统计学差异［OR=2.025,95%CI=(1.170, 3.504), P=0.012＜0.05］及大体积肌瘤(最大 肌 瘤 长 径≥5 cm)［OR=2.124, 95%CI=(1.300, 3.470),P=0.003＜0.05］、校正年龄后仍有统计学差异［OR=2.138,95%CI=(1.231, 3.714), P=0.007＜0.05］的风险显著增加。上述结果提示rs1285251 位点对子宫肌瘤患病风险的影响与年龄、肿瘤数量、肿瘤位置与最大肌瘤长径相关联。见表4。

表1 两组Hardy-Weinberg 平衡检验结果［n(%)］

表2 两组基因型频率及等位基因频率分布比较［n(%)］

表3 Logistic 回归分析CBX4 基因多态性与子宫肌瘤的关系

表4 CBX4 基因多态性与子宫肌瘤临床病理特征的分层分析

3 讨论

子宫肌瘤是常见的妇科生殖肿瘤。尽管其表现为良性生物学行为, 肌瘤所导致的异常子宫出血、疼痛、继发性不孕及感染等病变则严重危害女性身心健康及生活质量［13,14］。随着精准医学时代的来临, 从基因筛查层面提高肌瘤易感人群的识别度、探寻肌瘤生物学特征的预测靶点, 对子宫肌瘤早期预防监测、优化治疗方案及降低并发症风险均具有重要意义。

CBX4 编码基因位于17q25.3, 全长6.24kb, 包含5 个外显子与4 个内含子区［15］。本次研究中, 作者首次报道了CBX4 基因rs1285251 位点SNP 与子宫肌瘤发病及临床病理特征间的关系。结果表明与TC 或CC基因型携带者比较, TT 基因型携带人群罹患子宫肌瘤风险显著升高。分层研究显示, 该位点的风险效应存在于＜40 岁的女性。由于该年龄段女性处于育龄期,早期预测子宫肌瘤的发病风险无疑有助于加强预防监测, 保障生殖健康。大体积肌瘤、多发性肌瘤及肌壁间肌瘤都易于造成宫腔狭窄和子宫牵张, 是导致子宫出血、继发不孕与腹部坠胀疼痛的重要原因, 常需要临床治疗干预［16-19］。作者的研究提示TT 基因型恰是上述肌瘤特征的遗传易感因素, 因此, 其对相关人群的治疗决策有重要参考价值。

rs1285251 定位于CBX4 基因2 号内含子区［10］, 该SNP 位点C/T 碱基转换是否对CBX4 功能有调控作用目前尚不清楚。作者通过eOTLQen 平台(www.eqtlgen.org)对rs1285251 予以表达数量性状位点(expression quantitative trait loci, eQTL)分析［20］, 发现该位点T 碱基转换能显著上调CBX4mRNA 表达水平(资料未显示)。Berta 等［21］和Chuang 等［22］均证实与正常子宫肌壁比较, 子宫肌瘤组织中CBX4mRNA 表达水平明显升高, 并认为CBX4 高水平表达可能参与子宫肌瘤形成。由此推测, rs1285251 位点C/T 碱基转换, 可能通过促进CBX4 表达进而诱导子宫肌瘤的发生。事实上,CBX4 过表达已被证明在结肠癌、乳腺癌及骨肉瘤等多种肿瘤发生演进中发挥作用［15,23-25］。作者拟在其后的工作中对上述假说做进一步探索。

综上所述, CBX4 基因rs1285251 位点TT 基因型是子宫肌瘤易感因素, 其与发病年龄(＜40 岁)和肌瘤临床病理特征(大体积肌瘤、多发性肌瘤及肌壁间肌瘤)显著相关, 可为肌瘤的早期监测与个体化防治提供指导参考。