光化性角化病病人皮肤组织Toll样受体7蛋白表达及其临床意义

刘珈言，李二龙，梅蓉，杨礼凤，赵文彬，韩成龙，周慧

作者单位：四川大学华西医院皮肤性病科，四川 成都610041

光化性角化病（actinic keratosis，AK）是一类由长期日照或电离辐射导致的以皮肤表皮角化过度为主的皮肤病，多发于老年人与长期日晒群体［1］。既往报道表明［2］，AK是最常见的一种皮肤癌前病变，易发展为皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC），进而侵袭骨骼、肌肉等组织，甚至威胁病人生命。目前AK发展为cSCC的发病机制尚不明确，故探讨影响AK发展为cSCC的可能因素对临床治疗改善AK病人预后十分重要。李莎［3］等研究表明，Toll样受体7（toll like receptor 7，TLR7）蛋白是一种主要分布于免疫细胞的天然免疫受体蛋白，其可诱导机体的免疫反应，引发炎症，可能参与了AK的发病过程，其表达量随表皮病变恶化程度增加而上涨；此外，肿瘤与癌前病变会引发机体强烈的天然免疫，致使效应分子TLR7蛋白水平上调，而TLR7引发的持续性炎症会进一步促进肿瘤发展［4］，提示TLR7的表达可能与AK发展为cSCC存在一定的相关性。鉴于此，本研究特选取134例AK病人，探究其皮肤组织中TLR7蛋白的表达量与预后情况之间的关系，并分析AK病人皮肤组织中TLR7蛋白表达对其预后的预测效能，以期为AK病人的预后分析和早期治疗提供临床参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2019年1月四川大学华西医院134例AK病人的皮损皮肤蜡块标本作为观察组，选取同时期收集的129例健康人员的皮肤蜡块标本作为对照组。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

纳入标准：①观察组均符合《临床皮肤病学》［5］中AK的诊断表准，且均经病理学检查确诊；②AK病人确诊后均行激光-光动力疗法治疗；③受试者或其近亲属对本研究知情同意。排除标准：①合并其他良恶性肿瘤；②脂溢性角化、基底细胞癌等其他皮肤疾病；③皮肤组织获取前3个月内进行过治疗。

1.2 方法

1.2.1 皮肤组织TLR7检测方法 蜡块均连续4 μm切片，切片进行常规脱蜡水化，0.01 mol/L PBS冲洗，置于0.01 mol/L枸橼酸液（武汉博士得生物工程有限公司）中浸泡后，微波炉高火修复13 min，再冷却，PBS冲洗5 min，3%双氧水37 ℃孵育20 min，滴加正常山羊血清37 ℃封闭30 min，舍去血清，加入一抗兔抗人TLR7抗体（1∶50稀释）与鼠抗人TLR8抗体（1∶100稀释）后，4℃冰箱中孵育过夜。次日取出37 ℃复温60 min，加入生物素标记的二抗孵育0.5 h，辣根酶标记的链霉卵白素工作液37 ℃ 0.5 h，PBS冲洗，DAB染色后，冲水10 min，苏木精复染1 min，脱水，透明后，滴加中性树胶封片，显微镜下观察。

1.2.2 TLR7表达量确定 片状棕黄色染色为阳性表达，通过计算机Image pro Plus 6.0（IPP）软件分析图片，选择图片着色最密集最深的区域为基础，计算阳性细胞的积分光密度值（integrated option density，IOD），OID越高，TLR7蛋白表达越高。

1.2.3 AK病人预后情况判断剂分组 对观察组病例病人均随访3年，将发展为cSCC者归为癌变组，未发展为cSCC者归为非癌变组。

1.2.4 可能癌变组因素分析 比较分析可能导致AK病人癌变组的因素，包括年龄、性别、皮肤病史、病程、病理类型（肥厚型、萎缩型、原位癌样型）、Fitzpatrick皮肤分型以及皮肤组织TLR7蛋白表达量等，分析影响因素。

1.3 观察指标 （1）比较观察组和对照组一般资料及皮肤组织中TLR7蛋白的表达水平。（2）比较非癌变组与癌变组皮肤组织TLR7蛋白的表达水平。（3）癌变组因素logistic分析：比值比（OR）、95%可信区间（95%CI）。（4）皮肤组织TLR7蛋白表达量对AK发展为cSCC的预测效能：记录截断值、灵敏度、特异度、受试者操作特征（ROC）曲线下面积和95%CI。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件处理数据，计量资料采用表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验；对AK病人癌变的可能影响因素开展logistic回归分析，同时采用Hosmer-Lemeshow法对模型进行检验并对影响因素进行共线性诊断。采用ROC曲线分析皮肤组织中TLR7蛋白表达水平对AK发展为cSCC的预测效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组一般资料比较 观察组病程（26.08±5.11）月，其中肥厚型79例（58.96%），萎缩性22例（16.42%），原位癌样型33例（24.63%），单发皮损111例（82.84%），多发皮损23例（17.16%）。观察组和对照组性别、年龄、部位比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 光化性角化病和对照组一般资料比较

2.2 观察组与对照组皮肤组织TLR7蛋白表达水平比较 观察组的皮肤组织中TLR7蛋白表达量（23.76±3.90）高于对照组表达量（4.95±0.64），差异有统计学意义（t=54.08，P＜0.05）。

2.3 癌变组与非癌变组的皮肤组织TLR7蛋白表达水平比较 134例AK病人随访3年发生癌变21例，未发生癌变113例，癌变率为15.67%。癌变组的皮肤组织中TLR7蛋白表达量（27.37±3.19）高于非癌变组（23.08±3.66），差异有统计学意义（t=5.02，P＜0.05）。

2.4 AK病人癌变的影响因素分析 癌变组与非癌变组皮肤病史、病理类型、病程、皮损数量对比差异无统计学意义（P＞0.05）；癌变组病人的年龄大于非癌变组（P＜0.05），男性、Fitzpatrick皮肤分型为Ⅰ/Ⅱ型的病人占比及TLR7蛋白表达量均高于非癌变组（P＜0.05），见表2。

表2 光化性角化病癌变的单因素分析结果

经Hosmer-Lemeshow检验，logistic模型的观测值和期望值差异无统计学意义（χ2=4.75，P=0.596），说明该模型的拟合度良好。logistic回归分析结果显示，高龄、男性、Fitzpatrick皮肤分型为Ⅰ/Ⅱ型、皮肤组织中TLR7蛋白高表达均是AK病人癌变组的危险因素（P＜0.05），对筛选出的4个有统计学差异的变量进行共线性诊断，结果显示4个变量的方差膨胀因子（VIF）均＜10，说明自变量之间无共线性存在，具体数值见表3。

表3 共线性诊断和logistic回归分析结果

2.5 皮肤组织TLR7蛋白表达量对AK癌变组的预测效能 皮肤组织TLR7蛋白表达量预测AK病人预后情况的ROC曲线见图1，截断值为25.34，灵敏度为80.95%，特异度为81.42%，ROC曲线下面积为0.81，95%CI：（0.74，0.88）。

3 讨论

AK是临床常见的一种损害性癌前皮肤病，在我国的发病率约为0.7%，其中约有0.025%～16.000%的AK病人会在后期发展为cSCC［6］。cSCC具有浸润性、转移性、发展快、恶性程度高等特点，病人预后较差，严重威胁病人的健康［7］。目前，AK发展为cSCC的发病机制尚不明确，影响因素繁多，但鲜有对其影响因素的分析报道，故全面分析筛选AK发展为CSCC的影响因素对AK病人的早期干预和预后改善十分必要。

本研究显示，观察组病人皮肤组织中TLR7蛋白表达量高于对照组，说明TLR7蛋白在AK病人的皮肤组织中呈现异常高表达。TLR7作为TLR家族成员之一，具有与其他TLR相似的结构特征与功能作用，可通过识别细菌、病毒等外源配体的基因组DNA，促使免疫细胞分泌释放干扰素-α等炎性因子而发生免疫反应。AK病人的皮肤角质细胞已发生明显损伤，受损皮肤易被细菌、病毒感染而诱发上皮细胞中TLR7蛋白表达［8-9］，同时释放出大量干扰素-α，进一步促使B细胞内TLR7表达上调［10］，INF-α与TLR7表达之间的正反馈调节机制［11］致使AK病人的皮肤组织中TLR7表达水平显著升高。此外，本研究显示，癌变组皮肤组织TLR7蛋白表达水平高于非癌变组，且经logistic回归分析证实TLR7是AK病人癌变组的独立危险因素。既往研究［12-13］发现，在宫颈鳞癌、恶性上皮肿瘤病人中，TLR7蛋白发挥促肿瘤的作用。TLR的信号通路会显著影响肿瘤的发生与进展，肿瘤细胞表面活化的TLR7会促使核因子-kB水平上调，促使抗凋亡蛋白表达，进而诱发肿瘤［14］；此外，TLR7可调控肿瘤细胞对细胞因子和趋化因子分泌释放，诱导免疫细胞分泌炎性因子，从而削弱抗原提呈细胞和效应T细胞的抗肿瘤，引发“免疫逃逸”，导致肿瘤的恶性程度随TLR7表达水平的升高而升高［15］，因而AK病人皮肤组织TLR7蛋白表达水平越高，病人后期进展为cSCC的概率越大。于丽丽等［16］发现子宫内膜癌病人癌组织中TLR7表达水平明显高于不典型增生组织，且表达水平越高，预后越差；Liotti等［17］报道，非小细胞肺癌病人TLR7的表达水平升高；本研究与上述研究结果一致，均表明TLR7高表达与肿瘤发生相关。

此外，logistic回归分析结果显示高龄、男性、Fitzpatrick皮肤分型为Ⅰ/Ⅱ型均是AK病人癌变组的独立危险因素。究其原因：可能是高龄病人机体免疫功能减退，对肿瘤的发生与发展的抵抗能力下降；男性病人暴露于紫外线下的时间更长，皮肤病变程度更严重；Fitzpatrick皮肤分型为Ⅰ/Ⅱ型病人皮肤黑色素水平较低，对紫外线敏感程度高，更易引发皮肤病变。此外，本研究显示皮肤组织TLR7蛋白表达量预测AK病人预后情况的ROC曲线的灵敏度为80.95%，特异度为81.42%，ROC曲线下面积为0.81，表明其对AK病人的预后具有良好的预测效能。临床上可通过早期检测AK病人皮肤组织中TLR7蛋白的表达水平，及时筛选可能发生癌变组的AK病人，及早地实施干预治疗，对cSCC的预防具有重要的临床意义。

皮肤组织TLR7蛋白表达量对AK病人的预后具有良好的预测效能，是临床预判AK病人预后的有效方法，具有重要临床应用价值。但本研究仍存在一定的局限性，首先AK样本量选取较少，其次对于预后进展的随访时间仅有3年，缺乏更远期预后情况分析，仍需大样本的前瞻性研究进行长期随访验证结果。