荚膜甲基球菌蛋白的急性毒性和亚慢性毒性研究

张思微， 聂 雅 ， 刘 瑜， 高嫣珺， 卜仕金

（1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009）

随着全球畜牧和水产养殖业的发展， 鱼粉作为饲料的主要蛋白原料需求日益增加 （彭凯等，2022）。近年来，大宗饲料蛋白原料供应匮乏，鱼粉因其蛋白含量高、氨基酸平衡和适口性好等优点，价格居高不下（Guo 等，2022）。 植物蛋白如大豆粉、玉米粉等，来源广泛且价格低，是理想的鱼粉替代品（Gatlin 等，2007），但植物蛋白含有抗营养物质、氨基酸不平衡和纤维素含量高等缺点，限制了其进一步使用 （Hansen 等，2011；De Francesco等，2004），不受海洋资源、农业用地和气候变化限制的可持续蛋白质的需求不断增加（Dalton，2005），因此通过回收秸秆、温室废气等从细菌、真菌和微藻中获得的单细胞蛋白（SCP）具有广阔的应用前景（o/verland 等，2010）。 甲烷是天然气的主要成分，在自然界中分布广泛且供应充足，是产生菌体蛋白的理想培养基（傅晓莹等，2022；Hanson等，1996）。 荚膜甲基球菌蛋白（MBM）是一种由甲烷与荚膜甲基球菌自然发酵产生的SCP， 粗蛋白质含量高达65%，同时氨基酸组成平衡，相当于高品质鱼粉（Biswas 等，2020）。尽管作为鱼粉的替代物， 国内外已有研究证明了MBM 在多种动物的安全性和有效性（Hellwing 等，2006；Skrede 等，2003），但其在我国尚未批准作为饲料添加剂。《新饲料和新饲料添加剂管理办法》中（中华人民共和国农业农村部，2012）规定，新饲料添加剂的申请资料应包括毒理学安全评价报告。目前，国内鲜见对MBM 进行系统的毒理学评价研究， 本研究进行MBM 的大、 小鼠经口急性毒性试验和90 d 毒性试验即亚慢性毒性试验， 旨在确定其半数致死量（LD50）及长期饲喂不同剂量MBM 的有害效应剂量、毒作用性质和靶器官（沈建忠，2002），以期为MBM 的毒理学评价和临床使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 荚膜甲基球菌蛋白（MBM）：粗蛋白质含量≥65%， 褐色粉末。 批号为FNJ012-20210308，由恺迪苏（重庆）有限公司南京中试基地提供，使用0.5%羧甲基纤维素钠制备混悬液。羧甲基纤维素钠、甲醛、苏木素伊红、石蜡均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器 病理切片机，购自徕卡显微系统贸易有限公司；生物显微镜，购自德国ZEISS；电子天平，购自上海友声衡器有限公司；电子分析天平购自德国赛多利斯天平公司； 贝克曼Unicel Dxc800 synchron 型全自动生化分析仪；Sysmex XE-2100 型全自动血液分析仪。

1.3 试验动物与饲料 急性毒性试验：Wistar 大鼠（清洁级），6 ～7 周龄，雄性196.9 ～210.3 g，雌性180.8 ～185.2 g；ICR 小鼠 （清洁级），4 ～5 周龄，雄性18.8 ～22.0 g，雌性18.7 ～22.0 g，喂食普通饲料。 亚慢性毒性试验：Wistar 大鼠（SPF 级），4 ～5 周龄， 雄性70.6 ～103.0 g， 雌性80.3 ～106.9 g。 喂食添加不同浓度MBM 的饲料和空白饲料， 饲料委托江苏省协同医药生物工程有限责任公司加工制作。 动物均由扬州大学比较医学中心提供， 动物生产许可证号：SCXK （苏）2017-0007；使用许可证：SYXK（苏）2017-0044。

1.4 急性毒性试验设计 采用限量法设计MBM大、小鼠经口急性毒性试验。采用随机分组法将大鼠和小鼠各分为对照组和给药组，每组20 只（雌雄各半）。 大鼠分两次经口灌胃MBM 混悬液（0.5 g/mL），间隔4 h，每次剂量为10 mL/kg·bw；小鼠一次经口灌胃MBM 混悬液，剂量为20 mL/kg·bw。第1 天上午8 点染毒， 受试物在染毒结束后持续观察30 min，2 h 后再观察一次， 之后每天上午8点观察一次，连续观察14 d，期间动物自由采食和饮水。 试验期间观察记录动物健康状况、饮食、体重及死亡情况，观察结束后将所有存活大、小鼠处死后进行大体剖检观察。

1.5 亚慢性毒性试验设计

1.5.1 试验分组及给药 80 只大鼠随机分为4组，每组20 只（雌雄各半），分别为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，三个剂量暴露组的饲料MBM 添加浓度分别设为10000 mg/kg （相当于1.0%添加量）、25000 mg/kg（相当于2.5%添加量）和50000 mg/kg（相当于5.0%添加量），对照组给予空白饲料，连续给药90 d。

1.5.2 毒理学评价指标 试验期间， 每日进行一般与临床观察，记录异常现象。 每周称量体重，统计饮水及饲料消耗。试验中期（给药第45 天）和末期（给药第90 天）各组称重采血后剖杀10 只动物（雌雄各半）进行大体剖检，采集心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠、睾丸及卵巢称重并计算脏器系数，主要脏器组织进行组织病理学检查。 采集的血液用于血液学和血液生化相关指标的检测。

1.6 数据分析 试验数据以“平均值±标准差”表示，使用SPSS 26.0 进行统计学分析，单样本Kolmogorov-Smirnov 检验不同指标各剂量组数据是否符从正态分布， 符从正态分布的数据组间比较采用独立样本T 检验；不符从正态分布的数据组间比较采用Mann-Whitney 检验； 相关性分析使用Spearman 相关性分析，显著性水平为0.05。

2 结果

2.1 急性毒性试验结果 本试验剂量条件下，大、小鼠经口灌胃给予MBM 10 g/kg·bw 剂量，给药后未见明显异常反应。 试验第3 天给药组有一只小鼠死亡，剖检可见胃壁破裂，肝脏覆有药液，判断死因为灌胃操作不当， 其余大、 小鼠均未死亡。 试验观察期内采食、饮水和排便等均正常，体重正常增长，未出现中毒反应。试验结束时进行大体剖检，各脏器组织均未见明显异常，毒性剂量和毒性靶器官均未明确显示。

2.2 亚慢性毒性试验结果

2.2.1 临床表现 各组动物在给药期内， 均未出现中毒及异常死亡情况，行为活动、精神状态、分泌排泄物等临床观察内容均未见异常情况。

2.2.2 体重和摄食与饮水量 试验各周期雌、雄大鼠体重变化见图1a。 雄性大鼠低剂量组与对照组相比各周期均无显著性差异（P ≥0.05）；中剂量组第6 周与对照组相比差异极显著（P ＜0.01）；高剂量组第5、6 周显著高于对照组（P ＜0.05）。雌性大鼠低、 中剂量组各周期体重与对照组相比均无显著性差异（P ≥0.05）；高剂量组第3 周与对照组相比差异显著（P ＜0.05），第4 ～13 周差异极显著（P ＜0.01）。 相关性分析结果显示，雄性大鼠第5、6 和10 ～13 周、 雌性大鼠第3 ～13 周体重与MBM 饲料添加量呈正相关（P ＜0.05）。

图1 体重和摄食及饮水量结果

试验各周期雌、 雄大鼠平均饮水和摄食量见图1b。 与对照组相比，低剂量组雌、雄大鼠平均摄食量无显著差异（P ≥0.05）、中、高剂量组差异极显著（P ＜0.01）；低、中剂量组雌、雄大鼠及高剂量组雌鼠平均饮水量无显著差异（P ≥0.05）；高剂量组雄鼠平均饮水量差异极显著（P ＜0.01）。

根据平均摄食量和饲料MBM 浓度， 标准化MBM 摄入量：雄性大鼠平均每日MBM 摄入量分别为582、1601、3281 mg/kg·bw； 雌性大鼠分别588、1561、3138 mg/kg·bw。

2.2.3 血液学和血液生化 试验中期和末期，雌、雄大鼠各组血液学和血液生化检测结果分别见表1 和表2。 血液学检测结果显示，仅中期雄性大鼠淋巴细胞绝对值（LYM）与对照组差异显著（P ＜0.05）；血液生化检测结果显示，雌、雄大鼠各剂量组与对照组比较，各项指标在试验中、末期均无显著差异（P ≥0.05）。

表1 试验中期和末期雌、雄大鼠血液学检测结果

2.2.4 脏器系数和病理检查 试验中期和末期，雌、雄大鼠各组脏器系数见表3。 给药中期，与对照组各脏器系数相比，雄性大鼠低剂量组肾、睾丸差异显著（P ＜0.05）， 中剂量组肝脏差异极显著（P ＜0.01）；雌性大鼠中剂量组脾、肺及高剂量组脾、卵巢差异显著（P ＜0.05）。给药末期，与对照组各脏器系数相比， 雄性大鼠各剂量组均无显著差异（P ≥0.05）；雌性大鼠仅低剂量组肾脏及高剂量组肝脏差异显著（P ＜0.05）。

表3 试验中期和末期雌、雄大鼠脏器系数 %

试验中期和末期， 各剂量组与对照组大体剖检均未见任何肉眼可见的异常或病变。 进一步对试验末期高剂量组和对照组大鼠进行组织病理学检查，各组织器官组织病理学检查结果见图2，未观察到与给药相关的组织病理学变化。

3 讨论

《兽药急性毒性试验（LD50测定）指导原则》中（中华人民共和国农业农村部，2009）要求，剂量达5000 mg/kg·bw 时无动物死亡， 增加动物数至10重复两次无死亡，即可确定LD50。鉴于已有研究显示菌体蛋白在小鼠LD50≥20 g/kg·bw （赵叶，2009），结合前期预试验的剂量探索，为进一步精确LD50范围， 大、 小鼠急性经口毒性试验参考GB15193.3-2014（食品安全国家标准，2014）采用限量法， 即给予动物最大使用浓度和最大灌胃容量的MBM 溶液，由于大、小鼠的最大灌胃容量分别为4 mL/200 g·bw 和0.4 mL/20 g·bw，而其常用的单次灌胃容量分别为2 mL/200 g·bw 和0.4 mL/20 g·bw， 因此大鼠分两次灌胃给予MBM 混悬液。 尽管MBM 在水中具有较好的溶解性，但其水溶液很快产生沉淀， 为在正式试验时剂量足够准确，使用0.5%羧甲基纤维素钠制备混悬液，浓度为0.5 g/mL。 通过急性毒性试验确定LD50时，死亡动物数为其主要依据（孙明杰等，2022），试验中因灌胃操作不当导致给药组一只小鼠死亡， 未及时补充动物或提前增加备用动物， 这是本研究的设计缺陷之一。 由于前期预试验采用正式试验相同的剂量，动物死亡率为0/4，因此该小鼠的死亡并未对结果的判定产生影响。试验期间，其他动物均未出现中毒反应和死亡， 且大体剖检各组织器官均未见病变， MBM 在大、小鼠的LD50均≥10 g/kg·bw。《兽药急性毒性试验（LD50测定）指导原则》中并未要求设置溶媒对照组， 本研究在急性毒性试验中大、小鼠各设置相同动物数的对照组，旨在排除由试验操作等引起的误差， 并获得体重数据为后期试验提供参考， 体重在本研究中不作为判定毒性的指标，因此不在本文中呈现。

亚慢性毒性试验中， 饲料中MBM 添加量为1%、2.5%和5%，饲喂大鼠90 d，各剂量组动物均未出现中毒表现，表现出良好的耐受。 试验期间，雄性大鼠中、 高剂量组个别周期体重显著高于对照组，相关性分析结果显示除差异显著的周期外，另有部分周期与MBM 饲料添加浓度呈正相关；与雄性相近，雌性大鼠自第3 周至第13 周，体重均显著高于对照组， 且与MBM 饲料添加浓度呈正相关。 由此可见，在5%浓度范围内，大鼠部分生长周期体重随MBM 饲料添加浓度增加而增加，且这一现象在雌性大鼠更为突出。一项对日粮蛋白质水平的研究表明， 日粮蛋白质水平的提高增加了生长期大鼠对饲料的转化效率， 从而使大鼠体重增加（刘闯，2014），由此推测本研究中动物体重的统计学差异可能与MBM 较高的蛋白含量有关，伴随动物体重增加，部分组别平均摄食和饮水量的存在显著差异，与MBM 毒性无关，为正常生理现象。 本研究未在空白对照组以外设置与高剂量组饲料蛋白质水平相当的对照组， 为本研究的设计缺陷之二。 血液学和血液生化指标仅雄性大鼠给药中期LYM 存在显著差异，但未呈剂量相关性且至末期差异即不存在， 同时该值在Wistar大鼠的参考值范围内（钱江等，2018）。 试验中期雌、 雄性大鼠三个剂量组个别脏器的脏器系数与对照组相比存在差异，但至末期差异已不存在；雌性大鼠至试验末期， 高剂量组肝和低剂量组肾与对照组比较存在差异，病理学检查和反映肝、肾功能血液生化指标均未提示该差异与MBM 毒性有关，推测为动物生理状况差异所致。以上指标统计学分析结果结合对照组和高剂量组中大体剖检和组织病理学检查，表明MBM 1%、2.5%和5%添加于饲料，连续饲喂Wistar 大鼠90 d，各剂量组均未出现明显的毒性作用。

4 结论

本试验剂量条件下，急性毒性试验结果表明，MBM 在大、 小鼠的LD50均≥10 g/kg·bw， 根据WTO 有关外源性化学物急性毒性分级标准进行评价，属实际无毒；亚慢性毒性试验结果表明，添加5%MBM 于饲料中连续饲喂大鼠90 d， 未观察到明显的有害作用，无作用剂量至少达到3100 mg/kg·bw。 MBM 作为饲料添加剂使用基本安全。