枳雀幼嫩茎段组织培养快速繁殖体系研究

王浩田,蒋景龙,吴 强,秦公伟,任可心,李 丽,丁德宽

(1 陕西理工大学生物科学与工程学院,陕西汉中,723000;2 汉台区蔬菜果品技术推广中心,陕西汉中,723000;3 城固县果业技术指导站,陕西汉中,723200)

“枳雀”(CitruswilsoniiTanaka ‘Zhique’)为芸香科,柑桔亚科,柑桔属,香圆种植物,别名有香橼、气柑、宜昌柠檬等,是陕南地区一种天然地方柑桔品种,至今已有500多年的栽培历史,目前发现枳雀的最大树龄已经超过300年,生产中又可分为粗皮枳雀和细皮枳雀两种类型[1-3]。李航等[4]研究认为,枳雀的母本为柚类或者具有柚类母本血缘的杂交柑桔品种,父本是一个具有枳的血缘的杂交柑桔品种。枳雀是陕南柑桔苗木繁育重要的优良砧木之一。枳雀做柑桔砧木,具有很强的抗性,如:抗旱性[2]、抗盐碱性[3]以及抗冻性[5]等,并且在碱性土壤条件下枳雀砧柑桔植株表现出极强的抗缺铁黄化性状[6]。据《中国药典》记载,枳雀青果切片制干药用在治疗咳嗽、炎症、多痰等症状中有重要作用[7]。

柑桔具有童期长、杂合度高、多胚性等特点,这使得柑桔的定向改良育种与遗传亲本分析变得异常困难[8-9]。随着分子生物学和植物转基因技术的不断成熟,利用生物技术进行植物育种已经成为了可能。Hidaka等[10]在1990年首次利用根癌农杆菌转化技术获得了一株华盛顿脐橙转基因植株。当直接利用柑桔实生苗作为遗传转化的起始材料时,大多数柑桔实生苗仍处于童期,经遗传转化获得的转基因植物必须经过漫长的生长周期才能进行形态学观测和转基因植株基因性状表达等研究。以成熟柑桔茎段、顶芽和侧芽等外植体材料作为遗传转化的受体,能极大程度地缩短柑桔育种周期,但却存在再生率低等特点。柑桔组织培养相较于葡萄[11]、沙梨[12]等其他水果作物更加困难,这进一步增加了柑桔遗传转化的难度。因此,对于柑桔转基因研究而言,建立柑桔类植物高效稳定的快繁体系尤为重要。

柑桔组织培养已有50多年的历史。黄纯真等[13](1978年)利用成年金桔嫩枝侧芽为外植体,成功建立了金桔体外再生体系;Kobayashi等[14](2003年)以甜橙成熟茎段为外植体,通过微芽嫁接方法成功获得甜橙完整植株;陈国华等[15](2016年)研究了两个柑桔品种(红江橙、沙糖桔)的顶芽、侧芽、茎段对芽增殖的影响,建立了一种新型的柑桔脱毒苗快繁体系。柑桔组织培养技术已经日趋成熟。迄今为止,关于枳雀再生体系建立相关的研究仍未见报道。本研究以枳雀实生幼苗茎段为外植体进行组织培养快速繁育,旨在于建立一种高效稳定的枳雀快繁体系,为后续枳雀的遗传转化研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

枳雀实生苗种植于陕西理工大学植物逆境与细胞工程课题组培养室,待其生长到4个月大时取茎段为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 茎段表面消毒和接种 挑选长势良好的枳雀上部幼嫩茎段,自来水冲洗1～2 h,冲洗干净后剪切成2～5 cm长,转移至超净工作台,用75%乙醇溶液浸泡30 s,蒸馏水冲洗3次,0.1%升汞溶液浸泡6 min,蒸馏水冲洗3～5次,于无菌滤纸上吸干表面多余水分,再剪切成0.7～1 cm长,接种到MT培养基[14]中,在培养室进行培养。

1.2.2 培养条件 培养温度为(25±1) ℃,光/暗周期12 h/12 h,光照强度为2 000 lx,相对湿度为50%～60%。

腋芽分化条件筛选:选用MT基本培养基(pH值5.8),内含8 g/L琼脂和50 g/L蔗糖,分别添加0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的KT和6-BA,以MT培养基为对照。每个处理设置3组重复,每个重复接种5瓶,每瓶接种3个外植体。培养15 d后统计膨大率,培养30 d后统计腋芽诱导率和分化系数。膨大率=(膨大外植体数/接种外植体总数)×100%,腋芽诱导率=(出芽外植体数/接种外植体总数)×100%,腋芽分化系数=腋芽总数/接入外植体总数。

诱导生根条件筛选:挑选生长状态良好的芽,转接到添加有0(对照)、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL IBA的1/2 MT(内含8 g/L琼脂和50 g/L蔗糖)与1/2 MSN[16](内含7 g/L琼脂和30 g/L蔗糖)生根培养基中。每个处理设置3组重复,每个重复接种10瓶,每瓶接种2个外植体。培养45 d后对再生苗生长状况进行观察,并统计生根率和生根系数,培养90 d后观察根系生长状况。生根率=(生根芽数/接种芽总数)×100%,生根系数=生根条数/生根芽总数。

1.2.3 移栽和驯化 将根系发育良好的再生苗从培养基中移出,用无菌蒸馏水将培养基彻底冲洗干净,随后转移到含有灭菌营养土(泥炭土∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1)的花盆中,封口膜封口进行驯化处理。1个月后由培养室转移到室外培养并统计成活率。成活率=(成活苗数/移栽苗总数)×100%。

1.3 数据分析

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 茎段腋芽分化诱导培养

将消毒后的茎段接种于不同配方植物生长调节剂的培养基中培养,均能诱导腋芽分化。外植体培养第7天可观察到明显的膨大现象(见图1A),第10天时外植体上已经萌发出幼嫩腋芽(见图1B),第15天时腋芽已经逐渐舒展开且又有新腋芽长出(见图1C)。随着时间延长,腋芽进一步分化形成出新的茎和叶片。培养30 d时,新生的茎明显伸长且分化出3～5片叶片,与添加6-BA相比,未添加植物生长调节剂和添加KT的新生茎短而叶片宽厚(见图1D、E和F)。统计分析发现,当培养基中添加0.5 mg/mL 6-BA和1.0 mg/mL 6-BA时,均可取得较好的培养效果。其中,添加1.0 mg/mL 6-BA时,外植体膨大率(88.89%)、腋芽诱导率(88.89%)和腋芽分化系数(1.56)均最大,培养效果最佳(见表1)。可见,添加1.0 mg/mL 6-BA的MT培养基是诱导枳雀茎段腋芽分化的最佳培养基。

表1 不同浓度KT和6-BA对枳雀茎段腋芽分化的影响

注:A:外植体膨大(培养7 d);B:腋芽萌发(培养10 d);C:发育阶段的腋芽,箭头所示为新萌发的腋芽(培养15 d);D:附加6-BA形成的腋芽(培养30 d);E:MT培养基萌发的腋芽(不含任何激素,培养30 d);F:附加KT形成的腋芽(培养30 d)。

2.2 生根培养

将枳雀茎段诱导出的幼芽,在添加不同浓度IBA的1/2 MT和1/2 MSN培养基中进行生根培养。1/2MT培养基最早出根时间为9 d,1/2MSN培养基最早出根时间为18 d。培养45 d时,1/2MT培养基诱导出的根细长,而1/2MSN培养基诱导出的根则比较粗短(见图2A、B和C);在组培瓶中培养90 d时,根均进一步伸长且长出侧根,在1/2MT培养基中茎段生长迅速、侧根较少,在1/2MSN培养基茎段发育缓慢、侧根更多(见图2D、E和F)。统计分析发现,培养45 d,添加2.0 mg/mL IBA的1/2MT培养基的生根率(86.67%)最大,平均根长(7.75 cm)和生根系数(1.15)较大,总体生根效果最佳(见表2)。

表2 不同培养基和不同浓度IBA对枳雀幼芽生根的影响

注:A:1/2MT培养基,培养45 d;B:1/2MSN培养基,培养45 d;C:左为1/2MT培养基,右为1/2MSN培养基,培养45 d;D:1/2MT培养基,培养90 d;E:1/2MSN培养基,培养90 d;F:左为1/2MT培养基,右为1/2MSN培养基,培养90 d。

2.3 再生苗移栽和驯化

生根培养90 d、已经生根的再生苗,去除组培瓶封口膜,在培养室中敞口3 d。用镊子将根系发育良好的再生苗从培养基中轻轻夹出,注意不要损伤根系,随后移栽到灭菌基质上(见图3)。移栽好后,在培养室内采用封口膜封口(见图3)和定期敞口的办法进行驯化处理,即每3 d进行一次敞口,敞口时间随敞口次数的增加而延长,分别为1、2、4、8、12 h,最后完全敞口,1个月后转移至室外进行培养。移栽后完成驯化的幼苗,叶片鲜绿,茎段相比于移栽前进一步发育(见图3)。试验共移栽枳雀组培苗100株,成活率高达96%。

图3 枳雀组培苗的移栽和驯化

3 讨论

建立高效的植物再生体系是转基因研究的基础。目前关于柑桔组织培养的报道已有很多,但不同柑桔种类之间的再生仍存在一定差异。洪磊等[17]以化州桔红成年态半木质化新梢茎段为外植体的腋芽诱导率为60%以上。Ramha等[18]在关于“Maltese halfblood”的报道中,芽萌发率仅有40%左右。本研究中以枳雀实生幼苗茎段为外植体,腋芽诱导率高达88.89%。本试验结果与前人研究存在差异的主要原因可能是试验所取外植体及培养条件不同。

植物生长调节剂对植物离体再生发挥着关键作用。其中,细胞分裂素在植物芽再生过程中作用显著,大多数植物材料以6-BA最为有效,但不同材料最适6-BA浓度却存在较大差异[19]。文露清等[20]在研究金柑时发现,2.0 mg/mL 6-BA最适合进行幼芽分化。邹金美等[21]在研究文旦柚和下河蜜柚成年树幼嫩茎段外植体不定芽分化时仅添加0.5 mg/mL 6-BA便可取得较好的再生效果。本试验发现,最适合枳雀实生幼苗茎段外植体腋芽分化的6-BA浓度为1.0 mg/mL。以上结果证实6-BA在诱导芽分化过程中起着关键作用,最适6-BA浓度可能与柑桔种类等有关。

生长素在植物离体再生过程中对根系诱导有着显著的作用,其中以IBA的促根效果最好,且根的进一步生长较为正常。杨莉等[22]在诱导金柑生根时发现,添加3.0 mg/mL IBA的1/2 MS培养基更适于金柑幼芽生根,生根率为86.7%。Tongbram等[16]发现,在1/2 MSN培养基中添加1.0 mg/mL IAA更有助于粗柠檬(CitrusjambhiriLush.)幼芽生根,生根率为80%。本试验中,诱导枳雀幼芽生根的最佳培养条件为附加2.0 mg/mL IBA的1/2MT培养基,生根率为86.67%。

4 结论

枳雀幼嫩茎段外植体,以MT+1.0 mg/mL 6-BA培养基最适合腋芽分化,腋芽诱导率为88.89%,分化系数为1.56;最佳生根培养基为1/2MT+2.0 mg/mL IBA,平均根长为7.75 cm,生根率为86.67%,生根系数为1.15。本研究首次建立了柑桔品系枳雀的快速繁育体系,为后续的枳雀快繁体系优化及遗传转化工作奠定了基础。