基于数据挖掘的骨质疏松症动物模型建立与分析

周浩伟王秉谦张宇辰潘亚磊

（1. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2. 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育），陕西省创新药物研究中心，陕西 咸阳 712083）

骨质疏松症是一种以骨量低，骨组织微结构损坏，导致骨骼脆性增加，容易发生骨折为特征的全身性骨病［1］。 虽然目前抗骨质疏松症的药物种类和数量较多，但在疗效和减少不良反应上均有待改进，如骨吸收抑制剂双膦酸盐类可能会增加非典型股骨骨折和下颌骨坏死；骨形成促进药物甲状旁腺素类似物不建议长期使用，且需谨慎用于具有骨肉瘤潜在风险的患者［2］。 因此骨质疏松症的治疗药物仍是当前研究热点，而构建骨质疏松症动物模型是研究相关药物不可或缺的重要途径。 本研究检索近10 年来骨质疏松症相关动物实验研究文献，筛选出国内外期刊公开发表的有关骨质疏松症动物模型的实验研究论文，采用数据挖掘的方式对骨质疏松症动物模型的动物种类、造模方式、检测指标进行阐述，为今后骨质疏松症建模研究提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 数据来源

在中国知网、万方数据库、维普数据库、PubMed数据库中检索2013 年01 月01 日～2023 年01 月01 日有关骨质疏松症动物实验相关文献，使用高级检索，中文以“骨质疏松”和“动物模型”为主题检索；英文以“Osteoporosis”AND“models animal”为主题词检索。 共搜索出3810 条结果。

1.2 文献筛选标准

纳入标准：明确为骨质疏松症动物实验且数据详细的文献。 排除标准：（1）剔除动物模型不明、合并骨质疏松、骨质疏松为其他疾病并发症、数据不全及存在缺漏的文献；（2）剔除综述、理论研究、学位论文、会议类文献。 最终仅选用模型条件完备（动物种类、性别、造模方式、检测指标等明确）的且可获得全文的期刊文献，总计457 篇，其中中文224篇，英文233 篇。

1.3 统计学分析

应用Excel 软件，将纳入的457 篇文献中的实验动物种类、体重、性别、造模方式、检测仪器、检测指标等信息汇总整理成骨质疏松症动物模型数据库。 动物种类、名称等均参照《实验动物与动物实验技术》进行规范［3］。 使用Excel 进行频次分析，采用SPSS Modeler 18.0 对检测指标进行关联规则分析。

2 结果

2.1 实验动物类别

在筛选后的457 篇文献中，频数和占比前5 的骨质疏松症模型动物分别为： 大鼠（315 次，68.9%）、小鼠（84 次，18.4%）、兔子（19 次，4.2%）、斑马鱼（14 次，3.1%）、羊（13 次，2.8%）；此外，鳉鱼和树鼩为3 次，食蟹猴为2 次，猪、豚鼠、狗和鸡各1 次。

大鼠和小鼠是骨质疏松症动物模型首选动物。其次是兔子，相对于大、小鼠而言，兔子的耳朵硕大，耳缘静脉取血方便，便于长期动态观察血清生化骨代谢相关指标等。 羊作为较大体型的动物，易其骨骼标本易用作力学相关实验。 但兔子和羊的造模成本较高，饲养时间长，模型稳定性有待进一步研究。 斑马鱼具有成本低、易饲养、造模周期短、给药简单等优点，且与哺乳动物基因高度同源性，因而近年来使用斑马鱼建立骨质疏松症模型逐渐引起研究者的关注［4］。 但斑马鱼仍具有造模方式单一、难以连续观测等缺点，在研究时应根据所考察指标选择使用。

2.2 造模方式

在文献数据库中，骨质疏松症造模方式和占比统计结果为：手术造模占比72.6%，药物诱导造模占比19.5%，手术合并药物造模方式占比4.8%。此外，还包括少量其他造模方式如饮食诱导、缺铁性贫血、酒精刺激、基因调控等。

手术造模具有效果稳定、可复制性强、实验结果可信度大、应用较为广泛等优点。 但手术创伤初期引起的应激反应会干扰血清代谢等检测指标，手术造模所需周期也较长。 药物造模的优点为建模周期短、操作简便。 但药物造模的成模效果不稳定，停用药物后骨量丢失会逆转，而药物过量则会造成骨坏死、免疫抑制等并发症。

2.2.1 手术造模

在332 篇手术造模文献中，频数和占比前3 位的为：去卵巢（320 次，96.4%）、去睾丸（6 次，1.8%）、去坐骨神经（3 次，0.9%）；此外，去臂丛神经、切除静脉和去5／6 肾各出现1 次。

去卵巢是首选手术造模方式，其可模拟妇女绝经后骨质疏松症。 在去卵巢手术文献中，背部入路占比28.1%，腹部入路占比17.8%，其余未明确手术入路方式。 从腹部入路摘除卵巢时，容易找到卵巢，操作相对简单、易行［5］。 但动物爬行时腹部在垫料上摩擦，加之啮齿类动物会舔舐伤口，使得伤口较易撕裂或感染。 从大鼠背部做切口摘除卵巢时，需要在背部正中线做一个2 cm 左右的切口，大鼠背部肌肉发达，较腹部入路缝合复杂，但具有不易感染、脱线和伤口愈合更快等优点［6］。

2.2.2 药物诱导造模

药物诱导是研究继发性骨质疏松症的造模方法。 有明确给药途径、给药剂量和造模时间的中文文献统计见表1，英文文献统计见表2。 造模所用大鼠体重大多在180 ～300 g 之间；小鼠的体重在18～27 g 之间。 动物在成年之前，体重和月龄呈正相关，目前骨质疏松症药物诱导造模所用大鼠和小鼠的月龄跨度较大，这可能会因动物的月龄差异导致骨质疏松症形成系统误差。 造模所用药物种类，中文文献维甲酸和糖皮质激素类（地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、强的松）各约占据一半，英文文献除1 例维甲酸，其余全部为糖皮质激素类。 从给药途径来看，维甲酸均采用灌胃法，糖皮质激素类则采用注射方式，但注射部位包括肌内注射、皮下注射、腹腔注射、腹膜内注射、静脉注射等。 从给药剂量来看，维甲酸给药剂量较集中采用70 ～100 mg／kg；糖皮质激素类则差异较大，如地塞米松肌内注射剂量为1 ～21 mg／kg。

表1 骨质疏松症药物诱导造模中文文献统计Table 1 Statistics of Chinese literature on drug induced modeling of osteoporosis

表2 骨质疏松症药物诱导造模英文文献统计Table 2 Statistics of English literature on drug induced modeling of osteoporosis

2.3 检测指标

骨质疏松症动物实验常用检测指标见表3。 骨密度测定常采用双能X 射线骨密度仪，其以X 射线通过动物组织时的衰减差异来分析骨骼和软组织的数量，能够量化实验动物的骨密度，测量结果准确性和精确性高，是骨质疏松症无创性检查的金标准［50］。 血清骨代谢相关生化指标包含骨钙素、Ⅰ型胶原氨基端前肽、Ⅰ型胶原C 端交联肽、甲状旁腺素、25-羟基维生素、骨特异性碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等，同时也测定钙、镁及磷等元素含量变化，从而反映骨代谢变化，有助于评估骨质疏松症的模拟状态或者疗效［51］。 Mirco-CT 可分析骨骼微结构得到包括骨体积／组织体积（BV／TV）、骨表面／骨体积（BS／BV）、小梁数（Tb.N）和小梁厚度（Tb.Th）、小梁分离（Tb.Sp）和结构模型指数（SMI）等参数，实现对骨骼三维结构的重建，此外Mirco-CT 还可检测股骨组织微血管形态［52］。 与三维的骨微结构相比，制作骨切片在平面上可观察骨组织形态和病理状态，采用苏木精-伊红（HE）染色、油红O 染色、Masson 染色、甲苯胺蓝、丽春红等染色法及钙黄绿素、四环素等荧光标记后可间接动态考察骨组织中骨代谢状态。 骨生物力学测试方法有轴向压缩实验、扭转实验、轴向拔出实验、三点弯曲实验和四点弯曲实验等，其中三点弯曲实验使用频数最高，占比为55.9%。 骨生物力学测定部位频率由高到低为股骨、胫骨、腰椎骨和肱骨。 常用骨生物力学测定指标及使用频率占比为最大应力（84.4%）、最大载荷（79.8%）、刚度（42.2%）、弹性模量（37.7%），此外还包括压缩模量、杨氏模量和能量等指标。 最大应力是导致骨断裂所需要最大的力，能够直观地评价骨质疏松症发生骨折的可能性。 最大载荷是骨骼能承受的极限载荷，体现的是骨骼的韧性与抵抗外力的损伤能力，提升骨最大载荷可以显著降低骨折发生的风险。 表3 为单项检测指标占统计文献的比例，占比相加不等于1。

表3 骨质疏松症动物模型检测指标Table 3 Testing indexes of osteoporosis animal model

2.4 关联规则分析

采用经典的Apriori 算法进行关联规则分析进一步挖掘骨质疏松症各指标间的联系。 设置支持度为10%、置信度为50%、最大前项数为5、增益＞1， 共计得到6 组配对。 检测指标关联情况见图1，关联规则分析结果见表4。 结果显示，血清骨代谢相关生化指标、骨微结构和骨组织形态／病理观察均与骨密度两两紧密联系，表明这些指标与骨密度一起均为评价骨质疏松症的重要依据。 此外，虽然骨生物力学／骨强度与骨密度关联性较弱，对评价骨质疏松症作用较小，但测量生物力学是预测骨质疏松症最常见并发症骨折的有利方式，在今后研究中应引起重视。

图1 检测指标网络关联图Figure 1 Network association diagram of testing indexes

表4 骨质疏松症检测指标关联规则分析Table 4 Analysis of association rules of osteoporosis testing indexes

3 讨论

骨质疏松症动物模型的建立是研究其发病机制和研发新药的关键步骤。 本文通过统计近10 年国内外骨质疏松症实验动物种类，发现虽然所用动物种类较广，但就目前而言骨质疏松症动物模型造模大多选取大鼠和小鼠。 大鼠骨骺板缺乏真正闭合以及与人类的骨骼差异大，作为骨质疏松症模型存在一定缺陷［53］，但因其遗传背景清楚、易操作、价格较低的特点［54］，常作为造模首选。 在原发性骨质疏松症模型中，雌性大鼠手术去卵巢是美国食品和药品管理局和世界卫生组织推荐的研究绝经后骨质疏松症模型［55］。 而继发性骨质疏松症模型以糖皮质激素类药物诱导大鼠为主。 笔者通过分析文献认为骨质疏松症动物造模存在以下三点有待改进之处：第一，药物诱导造模给药剂量和造模时间差异较大，这些可能会显著影响动物骨质疏松程度，因此需要对不同药物诱导方法做系统比较研究；第二，研究者所采用的动物体重差异较大，动物月龄（体重）会显著影响骨密度和骨生物力学［56］，后续研究需要规范化；第三，应注重自然衰老动物骨质疏松症的研究，自然衰老模型更符合人类增龄衰老产生骨质疏松症这一客观规律。 骨密度和骨微结构可以直接反应骨质疏松程度，而血清生化骨代谢相关指标和骨组织形态／病理观察可反应骨形成和骨吸收状态。 骨质疏松性骨折是骨质疏松症严重的并发症，据统计发生骨质疏松性髋部骨折后患者的一年内的死亡率高达30%，残疾率大概占50%［57］，因此骨生物力学指标的测量显得尤为重要。 总之，骨质疏松症动物模型需要多指标评价。

综上所述，骨质疏松症动物模型目前使用频率最高的为雌性大鼠去卵巢，评价骨质疏松症需要骨密度、血清骨代谢相关生化指标、骨组织形态及病理观察、骨微结构和骨生物力学等多指标的综合判定。 今后需要规范骨质疏松症动物模型的造模方法，并结合骨质疏松症的病因，创建更加符合人类骨质疏松症特点的标准化动物模型，这对骨质疏松症的研究和治疗具有重要的意义。