基于数据挖掘的乙型肝炎病毒感染动物模型研究

李晓斌刘博文李峰苏晓鹏胡世平*

（1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学深圳医院，广东 深圳 518172）

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种非细胞病变的DNA 病毒，基因组长约3.2 kb，为部分双链环状DNA。 HBV 通过肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸协同转运蛋白进入肝细胞，在受感染肝细胞的细胞核中产生共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）［1］，接着转录成前基因组RNA（逆转录为HBV DNA 的模板）和mRNA 以翻译成HBV 蛋白。 cccDNA 是HBV 难以根除和实现免疫抑制后HBV 重新激活的主要原因［2］。 HBV DNA 可以整合到宿主基因组中，并且可以是HBsAg 的来源，也是肝癌发生的促成因素［3］。 目前全球有超过2.5 亿人为慢性HBV 感染者（定义为HBsAg 阳性）［4］，其中未经治疗的患者约40%发展为肝硬化，且存在进展至失代偿性肝硬化和肝细胞癌的风险［5－7］。 目前慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的治疗以干扰素和核苷类似物为主，但无法清除肝内的cccDNA 以达到功能性治愈，故深入开展CHB 发病机制及各种干预过程的有效性研究，对根除肝内的cccDNA 具有重要意义。

有效动物模型的建立对于机制研究及新药研发至关重要，本研究检索近10 年来HBV 感染相关的文献，筛选出国内外期刊公开发表的涉及HBV 感染动物模型的论文，对HBV 感染动物模型的动物种类、造模方法、检测指标进行阐述，为今后HBV 感染建模研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

计算机检索中国知网、万方数据库、维普中文期刊服务平台及PubMed 数据库，收集从2012 年1 月1 日至2022 年12 月31 日发表的研究，检索方法均为高级检索，中文数据库以“HBV”、“乙型肝炎病毒”、“动物模型”为主题词检索，英文数据库以“HBV”、“hepatitis B virus”、“animal model”为主题词检索。

1.2 文献筛选标准

1.2.1 纳入标准

（1）涉及HBV 感染动物模型且全部造模成功的实验类文献；（2）模型资料完备（动物种类、造模方式、成模标准、检测指标等明确）；（3）可获得全文，语种不限。

1.2.2 排除标准

（1）无法获取造模方式、造模药物、检测方法、检测指标等详细的资料；（2）重复文献仅选取发表时间最早的一篇；（3）会议、学位论文、报纸、综述、理论研究。

1.3 数据处理

将收集的文献中涉及的动物种类、造模方法、检测指标等以统一格式录入Microsoft Excel 2013，采取双人录入的方法以确保信息的质量控制，整理并建立HBV 感染动物模型的数据库。

1.4 统计学分析

应用Microsoft Excel 2013 对HBV 感染动物模型数据库中的信息进行统计分析，归纳造模要素［8］。

2 结果

2.1 文献检索结果

共检索出1216 篇文献，包括中国知网311 篇、万方524 篇、维普56 篇、PubMed 325 篇，剔除重复文献677 篇，阅读题目与摘要后剔除综述、理论研究、会议类、学位论文及无关文献共257 篇，阅读全文剔除不符合1.2.2 排除标准的文献，最终纳入文献59 篇。 其中英文文献17 篇，中文文献42 篇。

2.2 实验动物种类

将59 篇纳入文献中应用的实验动物种类进行统计发现，主要包括6 类实验动物，即小鼠、大鼠、鸭、土拨鼠、猴、树鼩。 如表1 所示，将实验动物种类按照频数进行排序，其中使用频数最高为C57BL／6小鼠（23 次，32.38%） 和BALB／c 小鼠（13 次，18.30%），其次较为常用的有鸭、土拨鼠等。 造模动物的性别以雄性为主，分布见表2。

表1 实验动物种类频数分布Table 1 Frequency distribution of experimental animal species

表2 实验动物性别及频次Table 2 Sex and frequency of functional dyspepsia model animals

2.3 造模方式

将文献中的造模方法进行统计分类，归纳为6种。 最常用的为水动力高压注射法（28 次，47.46%），其次为静脉注射（注射部位涉及颈静脉、胫静脉及颈外静脉等）、腹腔注射重组腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体介导的HBV 感染、转基因、皮下注射及先天感染。 每一种造模方式的分布及原理见表3。

表3 造模方式分布Table 3 Distribution of modeling methods

2.4 模型给药时间及阳性对照药

共20 项研究涉及药物干预，其中13 项研究设置阳性对照药物。 经统计，给药时间多为14 d（7 次， 35.00%），其次为28 d（3 次，15.00%）。 阳性对照药均为抗病毒药物，包括拉米夫定（9 次，69.23%）、阿昔洛韦（3 次，23.08%）及恩替卡韦（1 次， 7.69%）。

2.5 检测指标

对本研究中涉及的全部检测指标进行分类统计，若同一组织被用于检测不同的指标，如肝组织既做病理检测又做免疫组化，则分别进行统计。 结果表明检测指标主要包括HBV 相关血清学指标、转氨酶、肝组织病理、肝组织免疫组化等。 其中，检测前3 位的指标包括血清HBsAg（46 次，18.18 %）、血清HBV-DNA（43 次，17.00 %）、血清HBeAg（35次，13.83 %）。 检测指标的频数分布见表4。

表4 检测指标频数分布Table 4 Frequency distribution of detection indicators

3 讨论

目前CHB 的治疗尚未实现功能性治愈，达到这一目标需要满足多个步骤：完全抑制HBV DNA 复制及HBsAg 产生，恢复先天性和HBV 特异性免疫应答［9］，因此靶向HBV 复制生命周期不同阶段的药物及免疫调节剂仍是目前的研究热点。 基础研究中选择合适的动物模型至关重要。

3.1 常用实验动物

理想的临床前动物模型既需要模型中有较高的HBV 病毒含量，也需要相应的免疫环境［10］。 目前用于制备HBV 感染模型的动物主要有鼠、鸭、土拨鼠、树鼩、食蟹猴等，其中以小鼠最常用。 HBV 感染具有极强的种属特异性，仅黑猩猩和食蟹猴存在HBV 的自然感染，感染后的宿主反应与人类相似，是研究分子机制、评估疫苗功效和抗病毒药物等的首选［11］。 但受动物伦理的限制和高昂成本的影响，美国国立卫生研究院逐渐限制非人灵长类动物在生物医学上的研究应用。 Fan 等［12］研究发现树鼩是灵长动物的近缘旁系群，并创建了树鼩基因组数据库。 树鼩在基因组和免疫学特性等诸多方面与人类相似，在新生儿感染时表现出慢性感染倾向，肝组织病理学变化接近人类感染HBV 后的改变，可通过感染人HBV 建立慢性感染模型，成为除灵长类动物外可天然感染人HBV 的动物，但遗传稳定性不足、个体差异大、实验结果的重复性较差［13］，在应用上受到极大限制。 而土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatits virus，WHV）和鸭肝炎病毒（duck hepatits virus，DHBV）与人HBV 具有相似的复制周期和感染相应宿主的特性，可作为研究人HBV 的替代病毒，故土拨鼠肝炎模型和鸭乙型肝炎模型在研究中较为常用。 但WHV 与DHBV 均与人HBV 的同源性差，也不能充分体现人HBV 感染的全过程。

而小鼠与人类具有相似的遗传背景，且体型小、易获得、易饲养管理，已被广泛应用于实验研究。 小鼠无法自然感染HBV，多通过高压水动力注射法、重组AAV 载体介导法、转基因法等制备HBV感染模型。

3.2 常用造模方法

本研究结果发现，在小鼠中最常用的造模方法为水动力高压注射法和重组AAV 载体介导的HBV感染。 水动力高压注射法（hydrodynamic injection，HDI）是指将含有HBV DNA 质粒的溶液通过小鼠尾静脉快速注射进小鼠体内。 由于高压下血循环的冲击，使输入的DNA 片段可以进入肝细胞内，通过转录前基因组RNA 和其他HBV mRNA 启动HBV复制，形成HBV 复制中间体并表达HBV 蛋白［14］。HDI 的标准程序需要在8 ～10 s 内快速注入相当于12 ～13%小鼠重量（g）的液体［15］。 HDI HBV 小鼠模型可用于建立瞬时或持续性HBV 复制，外周血中HBsAg 阳性的持续时间从1 周～6 个月。 该模型中HBV 的持久性由不同因素决定，包括小鼠品系的遗传背景、年龄、性别、质粒骨架和质粒剂量［16－23］。HDI 模型广泛应用于HBV 相关免疫应答机制及抗病毒药物的研究，还可通过构建不同HBV 基因型和变异或突变体的质粒来测试药物对突变HBV 的抗病毒作用［23］，并探索不同HBV 基因组株对HBV 感染持久性的影响及其潜在机制［17，24］。 但该模型仍存在很大的局限性：首先，HDI 的高压注射会造成严重的肝损伤；其次，质粒骨架引起的非HBV 免疫应答可能会干扰实验结果；最后，小鼠肝细胞在从rcDNA 形成cccDNA 方面效率极低，导致cccDNA 普遍缺失且肝内转染效率远低于HBV 感染患者。

重组AAV 载体介导的HBV 感染小鼠模型是将携带HBV 基因组的重组腺相关病毒（AAV-HBV）注射入小鼠体内（一般采取尾静脉注射），建立持续感染的HBV 小鼠模型。 AAV 属嗜肝病毒，具有低致病性和低免疫原性［25］，不同的HBV 基因型或突变体插入AAV 载体中可感染不同遗传背景的小鼠品系，故重组AAV 载体介导的HBV 感染小鼠模型在研究中应用广泛。 与HDI 相比，AAV-HBV 转导的小鼠模型能够实现更持续的HBV 感染，注射后12周约60%的肝细胞表达HBcAg［26］，且AAV-HBV 小鼠的血清HBsAg 即使在3 或4 个月内也保持在相对较高的水平［26－27］，因此该模型被优选用于评估慢性感染的治疗性疫苗和Toll 样受体激动剂的抗病毒作用［28］。 然而，AAV-HBV 是否通过rcDNA 在小鼠肝细胞中产生cccDNA 仍不确定。

除此以外，HBV 转基因小鼠模型在CHB 的发病机制及抗病毒药物筛选方面应用较多。 HBV 转基因小鼠可选择性表达HBV 蛋白（包括HBsAg、HBeAg、HBcAg 或HBX）及全HBV 基因组，前者可用于研究不同HBV 蛋白的病毒学和致癌潜力，后者支持HBV 在体内复制的完整生命周期，已被广泛用于评估抗病毒药物的疗效［29］。 但迄今为止产生的所有HBV 转基因小鼠谱系对病毒抗原具有免疫耐受性，不会发展为急性或慢性肝炎，并且这些全基因组转基因小鼠中缺乏cccDNA，这些可能限制此类模型的应用［30］。

3.3 高频检测指标分析

本研究发现实验中最常用的检测指标为HBsAg，其次为HBV-DNA 和HBeAg。 血清HBsAg来源于cccDNA 转录的mRNA 或整合人宿主基因组的HBV DNA 序列，HBsAg 阳性表示HBV 感染。 目前，HBsAg 的定量检测已在临床中被广泛应用，其水平可反映疾病分期与疾病的进展风险［31］。HBeAg 是具有免疫调节作用的可溶性蛋白，目前已被证实与HBV 感染后宿主免疫功能的紊乱密切相关［32］。 HBeAg 阳性一般表示宿主具有较强的传染性。 对于接受NAs 治疗的HBeAg 阳性CHB 患者，HBeAg 血清学转换与宿主产生部分免疫控制相关，故临床将其作为评价抗病毒疗效的重要指标［33］。血清HBV DNA 的水平可直接反映病毒复制情况，是HBV 感染后相对特异且灵敏的观测指标，也是在临床上被用作判断是否启动抗病毒治疗、预测疗效及预后的重要指标之一［34］。 以上指标均可反应宿主HBV DNA 的复制情况，在判断造模成功及药物疗效评价等方面均具有重要的意义，是实验中的常用检测指标。

3.4 结语

目前CHB 的治疗仍无法达到功能性治愈，CHB的生物学机制探讨和新药研发都离不开动物模型的支持。 构建理想的动物模型有利于产生更加严谨、科学的研究结果。 目前关于HBV 感染动物模型的选择尚无统一的评价标准，且国内外文献多以综述的形式列举动物模型的种类及各自的优缺点，尚无科学、客观的数据支持。 本研究应用数据挖掘的方法，通过构建数据库，将数据进行了深入的整合与分析，客观地展示了实际研究中HBV 感染动物模型的应用情况，供研究者参考。

本研究通过数据分析发现目前HBV 感染的动物模型多选择C57BL／6 小鼠和BALB／c 小鼠，其次为鸭和土拨鼠，造模方法以小鼠高压水动力注射和AAV-HBV 介导的转染为主，鸭和土拨鼠HBV 感染的模型构建方法多选择静脉或腹腔注射HBV 强阳性血清。 检测指标以HBV 相关血清病毒学指标为主，主要为HBsAg、HBV-DNA 和HBeAg，部分研究结合了肝组织病理检查及转氨酶水平来评估HBV感染后肝的疾病进展。

HBV 感染的动物模型造模方法多种多样，单一动物模型无法代表疾病的各个阶段，因此研究者应充分了解不同模型的优劣及适用场景，根据研究目的选择合适的动物模型，确保研究结果的科学性。由于HBV 的特殊性，目前常用的动物模型无法完全重现人体感染HBV 后的真实过程，因此建立与临床病理过程高度一致的动物模型是后续研究的关键。