博落回提取物对白羽肉鸡生长性能、免疫功能和肠道健康的影响

张国欣 潘 雪 孔令联 宋柏辰 宋志刚

(山东农业大学动物科技学院,泰安 271018)

自20世纪中叶开始,饲用抗生素在畜牧业生产中得到了广泛应用。抗生素的使用不仅提高了畜禽的抗病治病的能力,还促进了畜禽生长。然而,随着抗生素的滥用,细菌的耐药性逐步增强,抗生素的效果逐步下降,而且还在畜禽产品中有大量残留,对环境和人体健康造成了污染和危害[1-2]。因此,寻找绿色、安全、高效的抗生素替代品成为当前的研究热点,而酶制剂和植物提取物等均具有替代抗生素的潜能[3]。

博落回[Macleayacordata(Willd.) R. Br.]是一种多年生草本植物,是我国传统的中草药之一[4],其主要成分为血根碱和白屈菜红碱,具有抑菌、抗炎、提高免疫力和促进生长等多种作用[5-6]。Liu等[7]研究发现,在黄羽肉鸡饲粮中添加博落回提取物可以显著改善肠道形态和微生物群落结构。Guo等[8]研究发现,在雪峰乌骨饲粮中添加博落回提取物有利于肠道菌群群落的多样性和肠道形态的改善。目前,关于博落回在肉鸡上的研究集中在肠道形态和肠道微生物方面,而博落回对肉鸡免疫功能及相关基因表达的影响仍需进一步研究。因此,本试验旨在研究博落回提取物对白羽肉鸡生长性能、免疫功能和肠道健康的影响,为博落回提取物在白羽肉鸡上的应用提供参考基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验使用的饲料添加剂含有至少3.5%博落回提取物,其中血根碱含量≥1.5%,白屈菜红碱含量≥0.6%。

1.2 试验设计

试验选取体况一致和体重接近的1日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡公雏384只,随机分为3个组,每组8个重复,每个重复16只鸡。分群过程中尽量保持所有重复之间的整齐度相近(分群前称取鸡苗总重,除以总数得到平均值,乘以鸡只数量16得到平均每重复重量),重复之间重量差值控制在±70 g。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别饲喂在基础饲粮的基础上添加250(低剂量组)和350 mg/kg(高剂量组)博落回提取物的饲粮。

基础饲粮参考《产蛋鸡和肉鸡配合饲料》(GB/T 5916—2020)进行配制,其组成及营养水平见表1。试验期42 d,期间试验鸡采用笼养,自由采食和饮水,按正常免疫程序进行免疫接种。试验过程为保证试验效果严禁使用抗生素类药物,其他管理措施与常规饲养管理相同。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目Items含量 Content1～21日龄 1 to 21 days of age22～42日龄 22 to 42 days of age总磷 TP0.610.51有效磷 AP0.390.32

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生长性能

分别于13、24、30和42日龄时,对每个重复中的鸡只进行称重(禁食12 h后称重,以克为单位),并统计采食量,计算平均体重、平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 血清生化指标

30日龄时,分别于每个重复中选取体重接近的1只鸡翅下静脉采血3 mL,用采血软管采集血液后45°斜置,待血清析出后使用离心机3 000 r/min离心10 min,收集血清于1.5 mL离心管中,标记好后于-20 ℃保存待测。采用全自动生化分析仪(日立7170A)测定血清葡萄糖(GLU)、尿酸(UA)和甘油三酯(TG)含量。

1.3.3 外周免疫和肠道黏膜免疫指标

另外取血清利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17(IL-17)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和免疫球蛋白G(IgG)含量以及溶菌酶活性;同时,将采血后的肉鸡屠宰,采集空肠肠道黏膜样品,迅速放于液氮中,之后放置于-80 ℃冰箱中保存,测定空肠黏膜IgG和分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量,所需试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.3.4 空肠相关基因表达

将空肠组织与TRIzol匀浆后,使用试剂盒(RR820A,TaKaRa,日本)进行RNA分离和定量,采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA水平和纯度。使用Evo M-MLV反转录预混型试剂盒(AG:11728,购自湖南艾科瑞生物工程有限公司)进行逆转录,将所得到的cDNA产物置于-20 ℃保存。

采用SYBR Green(AG:11718,购自湖南艾科瑞生物工程有限公司)试剂盒在PCR仪(ABI-7500,美国)上进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测,反应体系包括10.0 μL SYBR®Green Pro Taq HS Premix(Rox Plus)(2×)、上游和下游引物各0.8 μL、2.0 μL cDNA和6.4 μL RNase free ddH2O,合计20.0 μL;反应条件:第1步95 ℃、30 s,1个循环;第2步95 ℃、5 s,60 ℃、34 s,40个循环。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因,采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。目的基因包括与空肠黏膜炎症介导信号相关的核因子-κB(NF-κB),与抗氧化应激相关的核因子E2相关因子2(Nrf2),以及与能量代谢相关的单磷酸腺苷活化蛋白激酶α(AMPKα)。相关基因引物序列见表2。

1.3.5 肠道指数和粪便含水量

30日龄时,分别于每个重复中选取体重接近的1只鸡,对肠道发育进行评分。采集十二指肠、空肠和回肠,分别测定各肠段的重量及长度,进行肠道指数计算,计算公式如下:

肠道相对长度=各肠段长度(cm)/
宰前活体重(kg);
肠道相对重量=各肠段重量(g)/
宰前活体重(kg)。

30日龄时,收集肉鸡新鲜粪便,粪便采取多点采样然后混合至均匀。收集的粪便样品称重约10 g(粪便重),在105 ℃下烘干4 h,在干燥器中放置常温后称量,直至粪便重量到达恒重(干粪重),计算粪便含水量:

粪便含水量=100×(粪便重-

干粪重)/粪便重。

表2 引物序列

1.4 数据统计与分析

试验数据采用SAS 9.1.3软件进行单因素分析,并采用Duncan氏法进行多重比较,结果以“平均值±标准误”表示,P<0.01表示差异极显著,P<0.05表示差异显著,0.05≤P<0.10表示有变化趋势。

2 结果与分析

2.1 博落回提取物对白羽肉鸡生长性能的影响

由表3可知,饲粮中添加博落回提取物能够显著提高白羽肉鸡25～30日龄ADFI(P<0.05),且以高剂量组ADFI最高。与对照组相比,低剂量组和高剂量组白羽肉鸡25～30日龄ADFI分别提高了4.92%和5.35%(P<0.05);高剂量组白羽肉鸡30日龄体重有提高趋势(P=0.068),14～24日龄F/G有降低趋势(P=0.060)。

2.2 博落回提取物对白羽肉鸡肠道指数和粪便含水量的影响

由表4可知,饲粮中添加博落回提取物能够显著降低30日龄白羽肉鸡粪便含水量(P<0.05);与对照组相比,低剂量组和高剂量组粪便含水量均显著降低(P<0.05)。3组之间肠道指数均无显著差异(P>0.05)。

续表3日龄Days of age项目Items博落回提取物添加水平Macleaya cordata extract supplemental levels/(mg/kg)0(对照 Control)250350P值P-value25～30日龄25 to 30 days of age30日龄体重 BW at 30 days of age/g1 565.42±28.161 599.89±14.841 644.36±22.090.068平均日增重 ADG/(g/d)404.60±33.59422.63±34.15466.86±19.000.333平均日采食量 ADFI/(g/d)743.46±13.88b780.06±9.57a783.22±9.45a0.036料重比 F/G1.91±0.131.73±0.071.70±0.080.2911～42日龄1 to 42 days of age42日龄体重 BW at 42 days of age/g2 277.36±87.112 336.80±68.992 394.10±36.370.486平均日增重 ADG/(g/d)2 233.81±87.102 293.12±69.042 350.00±36.280.487平均日采食量 ADFI/(g/d)3 368.43±69.713 416.89±66.383 331.16±32.440.592料重比 F/G1.52±0.041.50±0.051.42±0.030.212

2.3 博落回提取物对白羽肉鸡血清生化指标的影响

由表5可知,饲粮中添加博落回提取物对白羽肉鸡血清葡萄糖、尿酸和甘油三酯含量均无显著影响(P>0.05)。

表5 博落回提取物对白羽肉鸡血清生化指标的影响

2.4 博落回提取物对白羽肉鸡外周免疫和肠道黏膜免疫指标的影响

由表6可知,饲粮中添加博落回提取物能够极显著提高30日龄白羽肉鸡血清IL-10含量(P<0.01);与对照组相比,低剂量组和高剂量组血清IL-10含量均显著提高(P<0.05)。与对照组相比,高剂量组血清IFN-γ和TNF-α含量显著降低(P<0.05),血清IgG含量显著提高(P<0.05),血清IL-17含量有降低趋势(P=0.083)。3组之间血清IL-4含量和溶菌酶活性以及空肠黏膜IgG和sIgA含量均无显著差异(P>0.05)。

表6 博落回提取物对白羽肉鸡外周免疫和肠道黏膜免疫指标的影响

2.5 博落回提取物对白羽肉鸡空肠相关基因表达的影响

由表7可知,与对照组相比,低剂量组和高剂量组白羽肉鸡30日龄空肠NF-κB的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),且低剂量组显著高于高剂量组(P<0.05);高剂量组空肠AMPKα的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05);饲粮中添加博落回提取物对空肠Nrf2的mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)。

3 讨 论

3.1 博落回提取物对白羽肉鸡生长性能的影响

博落回作为多年生直立草本植物,其主要有效成分为血根碱和白屈菜红碱,具有极强的抗炎抑菌等功效,因其功效与抗生素类似,被人们广泛用做抗生素替代品之一。评估肉鸡饲养经济效益最直观的指标是生长性能,在实际生产中,F/G越低,说明其生长性能越好,反之则不然[9]。本试验中,饲粮中添加350 mg/kg博落回提取物使得白羽肉鸡14～24日龄F/G呈现降低趋势,这说明高剂量博落回提取物有助于降低F/G,带来可视化的经济效益;同时,博落回提取物添加组肉鸡25～30日龄ADFI显著提高,30日龄平均体重具有提高的趋势。Liu等[10]在探究博落回提取物对肉鸡生长性能和肝脏健康的影响中,发现42日龄时,博落回提取物添加组肉鸡体重和ADG均要高于对照组,F/G则低于对照组,本试验结果与其结果类似。黄海[11]和王曼等[12]研究表明,博落回提取物与金霉素的促生长效果一致,均可提高肉鸡生长性能。Suresh等[13]研究表明,饲粮中添加植物提取物同样对蛋鸡的生长性能有显著的改善作用。博落回的促生长机制是由于其主成分血根碱具有抑制胆碱酯酶活性、刺激唾液分泌等作用,进而提高了动物采食量[8]。

3.2 博落回提取物对白羽肉鸡肠道指数和粪便含水量的影响

肠道的健康发育直接影响机体对营养物质的吸收,进而说明其是影响生长性能的主要因素之一,而小肠作为机体消化吸收的主要部位,经常作为衡量动物肠道健康的重要标识。粪便的水分是研究动物腹泻状况和肠道吸水能力的重要指标[14]。Guo等[8]在饲粮中添加博落回提取物对乌鸡影响的研究中发现,博落回提取物可以改善不同肠段的肠道形态,进而提高肉鸡消化吸收能力,促进肉鸡的采食。本试验中,与对照组相比,博落回提取物添加组白羽肉鸡各肠断相对长度和相对重量不显著差异,而粪便含水量显著降低,表明肉鸡对水的重吸收能力显著增强,由此说明博落回提取物在改善肠道发育和吸收水分功能上发挥了一定的作用。

3.3 博落回提取物对白羽肉鸡血清生化指标的影响

血清生化指标直接反映动物机体内部的生理功能变化,可以通过血液了解机体营养代谢情况、器官功能的变化等[15]。众所周知,葡萄糖是机体能量平衡的重要物质,它的分解代谢可以合成许多非必需氨基酸供机体使用[16],而血清葡萄糖含量的提高预示着动物应激等不良状态[17]。血清尿酸含量是反映饲粮蛋白质代谢和氨基酸平衡的重要指标,血清甘油三酯含量则是反映机体脂代谢的常用指标,其异常升高是脂代谢发生紊乱的反映[18]。本试验中,饲粮中添加博落回提取物对白羽肉鸡血清葡萄糖、尿酸和甘油三酯含量均未产生显著影响,这说明博落回提取物并未对肉鸡造成应激、蛋白质代谢异常和脂代谢紊乱等不良影响。

3.4 博落回提取物对白羽肉鸡外周免疫和肠道免疫指标的影响

免疫系统是保护动物生命的“军队”,发挥着防御、监视和自稳的功能,其功能的强弱直接决定着动物机体的健康。辅助性T(Th)细胞根据分泌细胞因子的不同,主要分为Thl和Th2这2个细胞亚群[19]。Th1细胞主要分泌IFN-γ和TNF-α等,可下调IgA的分泌,激活巨噬细胞,增强细胞毒作用,介导细胞免疫应答;Th2细胞则是作为主导体液免疫的淋巴细胞,主要分泌IL-4和IL-10等,还可以刺激B淋巴细胞的增殖和浆细胞的产生[20]。据报道,在饮水中添加1%博落回提取物(血根碱含量为6.5 mg/mL)可显著提高肉鸡血清IgG含量,并显著降低血清白细胞介素-1β(IL-1β)含量[21]。本研究发现,与对照组相比,饲粮中添加350 mg/kg博落回提取物显著降低了白羽肉鸡血清IFN-γ和TNF-α含量,有降低血清IL-17含量有降低趋势,显著提高了血清IL-10含量。本研究结果表明,博落回提取物能够显著提高肉鸡Th2类细胞因子含量,增强Th2细胞主导的体液免疫功能,本试验与Guan等[22]在博落回提取物可减轻大肠杆菌应激小鼠的氧化应激的试验中发现,饲粮中添加博落回提取物的小鼠具有较高免疫活性的结论一致。

IgG是机体发挥免疫功效的重要抗体,也是家禽外周血中含量最高的免疫球蛋白,其含量占到了总免疫球蛋白含量的75%[23];同时,其也是体现家禽体液免疫功能的重要指标[24]。本研究发现,与对照组相比,白羽肉鸡血清IgG含量随着博落回提取物添加水平的提高而提高,且高剂量组与对照组相比差异显著,这验证了博落回提取物对抗体水平的影响,而康保聚[25]在博落回对仔猪的研究中同样也发现,在饲粮中添加博落回后,血清IgG含量有所提高。

3.5 博落回提取物对白羽肉鸡空肠相关基因表达的影响

研究表明,NF-κB在与免疫应答相关基因表达的调控中具有重要意义[26-27]。当机体受到抗原刺激时,NF-κB随即被激活,而后启动TNF-α等基因表达[28]。本研究发现,与对照组相比,饲粮中添加250 mg/kg博落回提取物显著提高了肉鸡空肠黏膜NF-κB的mRNA相对表达量,表明在博落回提取物的作用下,该基因通过TNF-α等细胞免疫途径,进而刺激机体的免疫系统,实现对机体的保护作用。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是一种应激活化激酶,是调节ATP与AMP比率的细胞内能量传感器,可以通过控制活性氧(ROS)的产生和c-Jun氨基末端激酶(JNK)-NF-κB信号传导来抑制缺氧应激引起的炎症反应[29]。AMPKα作为机体能量代谢调节关键因子,也是机体内各种刺激和影响细胞代谢的物质[30]。本试验发现,饲粮中添加350 mg/kg博落回提取物能够显著提高白羽肉鸡空肠AMPKα的mRNA相对表达量,表明博落回提取物可以上调细胞代谢和机体新陈代谢速度,增强空肠对营养物质的吸收、代谢和转化能力,有利于为机体供能和内环境稳定。

4 结 论

在本试验条件下,饲粮中添加350 mg/kg博落回提取物能够提高白羽肉鸡生长性能,降低粪便含水量和血清Th1类细胞因子含量,提高血清Th2类细胞因子和IgG含量,增强体液免疫功能,并通过上调免疫应答和能量代谢相关基因表达,改善肠道健康。