高效液相色谱法同时测定阿司匹林片中阿司匹林和水杨酸含量

赵 勇 郑金凤 刘雁鸣 张 悦

湖南省药品检验检测研究院 国家药品监督管理局药用辅料工程技术研究重点实验室，湖南长沙 410006

阿司匹林（乙酰水杨酸）作为一种经典的非甾体抗炎药，是临床上常用的解热、镇痛药物[1-2]。其生产过程中乙酰化不完全或贮藏过程中发生水解，均会产生游离水杨酸，水杨酸在空气中会被氧化成一系列醌型有色物质，影响产品的外观。同时水杨酸对肠胃有很大的刺激，逾量会产生中毒现象[3-4]。《中华人民共和国药典》收载的阿司匹林药物，其质量标准中均规定了阿司匹林的含量测定，以及游离水杨酸的测定[5]。有研究指出该方法虽能准确测定两者含量，但采用的水-甲醇的流动相体系中测定的阿司匹林和水杨酸的分离度不佳，存在一定程度的水解现象，使水杨酸的测量值比实际值偏大，并且采用甲醇处理样品易挥发，增大误差的产生[6-8]。因此，在《中华人民共和国药典》阿司匹林片游离水杨酸和含量测定项目的基础上，本研究对色谱条件进行了优化，修改了流动相，修订了供试品溶液的配制方法，建立了同时测定阿司匹林片中阿司匹林和水杨酸含量的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），为阿司匹林类药物质量标准制订提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪（沃特世公司），Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪（岛津公司），瑞士 Mettler-Toledo公司MS105DU 电子天平，精度为十万分之一。

1.2 试剂

阿司匹林对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100113-201706，纯度：99.8%）；水杨酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100106-201303，纯度：99.9%）；乙腈（德国CNW Technologies GmbH公司，批号：E5450210，纯度≥99.9%）；阿司匹林片（广东九明制药有限公司，国药准字H44020839，规格：0.3 g，批 号：20211014、20211015、20212201）；阿司匹林片（山西太原药业有限公司，国药准字H14022112，规 格：0.3 g，批 号：220901、221207、221405）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温25℃；紫外检测波长：237 nm；流动相为磷酸∶乙腈∶水=2∶400∶600（v/v/v）；流速：1 ml/min；进样量：10 μl。

2.2 溶液的配制

供试品溶液：取本品20片，精密称定，充分研细，精密称取细粉适量（约相当于阿司匹林10 mg），置100 ml量瓶中，加乙腈溶解后稀释至刻度，摇匀，滤膜滤过，取续滤液即得。

阿司匹林对照品溶液：精密称取对照品适量，用乙腈溶解并稀释成2 mg/ml的溶液，作为标准储备液。再分别精密量取适量标准储备液，用乙腈配制成10、50、100、200、500 μg/ml的系列对照品溶液。

水杨酸对照品溶液：精密称取对照品适量，用乙腈溶解并稀释成1 mg/ml的溶液，作为标准储备液。再分别精密量取适量标准储备液，用乙腈配制成2、5、10、20、50 μg/ml的系列对照品溶液。

空白溶液：乙腈溶液。

2.3 系统适用性试验

精密吸取上述空白溶液、对照品溶液及供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1，空白无干扰，理论板数按水杨酸计算不低于4000，水杨酸与阿司匹林间的分离度符合要求。

图1 系统适应性色谱图

2.4 线性关系、检测限与定量限

分别精密量取阿司匹林、水杨酸系列对照品溶液，进样，记录色谱图。以阿司匹林、水杨酸浓度为横坐标（X，μg/ml），以峰面积为纵坐标（Y），得回归方程：阿司匹林为Y=5481X-24.15，r=0.9998；水杨酸为Y=6542X+19.74，r=0.9999。结果表明，阿司匹林在10～500 μg/ml，水杨酸在2～50 μg/ml的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。采用信噪比法，按最小检测限要求S/N≈3计算检测限，阿司匹林检测限为1.54 μg/ml；水杨酸检测限为0.22 μg/ml。按最小定量限要求S/N≈10计算定量限，阿司匹林定量限为5.13 μg/ml；水杨酸定量限为0.73 μg/ml。

2.5 精密度试验

取阿司匹林、水杨酸对照品溶液，连续进样6次。结果阿司匹林、水杨酸峰面积RSD分别为0.74%、0.94%（n=6），说明仪器精密度较好。

2.6 重复性试验

取同一批样品（批号：20211014）按“2.2溶液的制备”平行制备6份供试品溶液，依法测定。结果样品中阿司匹林平均含量为99.9%，RSD为0.74%（n=6）；水杨酸平均含量为0.12%，RSD为1.2%（n=6），说明本方法重复性好。

2.7 稳定性试验

取样品（批号：20211014）按“2.2溶液的制备”制备供试品溶液一份，分别于0、4、8 h进样，记录峰面积。结果表明：供试品溶液放置8 h，阿司匹林、水杨酸峰面积RSD分别0.87%、1.25%（n=6），说明供试品溶液放置8 h内较稳定。

2.8 回收率试验

取样品（批号：20211014），共6份，精密加入定量阿司匹林、水杨酸对照品。按“2.2溶液的制备”制备供试品溶液，测定并计算回收率。结果阿司匹林平均回收率为100.04%，RSD为0.54%（n=6）；水杨酸平均回收率为98.47%，RSD为0.97%（n=6）。

2.9 耐受性试验

考察不同品牌色谱仪及色谱柱，对阿司匹林、水杨酸测定结果的影响。结果显示，在上述色谱条件下阿司匹林、水杨酸峰均可有效分离，阿司匹林、水杨酸峰测定结果RSD分别为0.07%、2.78%（n=2），见表1，说明本法耐用性较好。

表1 耐受性试验结果（批号：20211014）

2.10 样品测定

样品测定结果均符合规定（《中华人民共和国药典》标准规定，水杨酸：不得过阿司匹林标示量的0.3%；阿司匹林：应为标示量的95.0%～105.0%），见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择

阿司匹林是一种水解性极强的药物，《中华人民共和国药典》中以水-甲醇流动相检测时存在一定程度的水解现象，使得水杨酸的测量值比实际值偏大。另国家药品监督管理局国家药品标准WS1-（X-048）-2005Z 阿司匹林缓释片中采用乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（23∶5∶5∶61）为流动相检测游离水杨酸，四氢呋喃对环境不友好，故本研究选择乙腈-水系统为流动相[9]。

阿司匹林在碱性条件易水解，且水解程度与溶液pH值有关，选择实验常用的磷酸为pH调节剂，考察乙腈∶水不同比例[300∶700、400∶600、500∶500、600∶400（v/v）]下 磷 酸 加 入 量 对阿司匹林与水杨酸的分离情况及阿司匹林的稳定性的影响[10-11]。结果显示，当磷酸∶乙腈∶水=2∶400∶600（v/v/v）混合体系作为流动相，流动相pH值为2.3，阿司匹林与水杨酸能完全分离，且阿司匹林在8 h内稳定性较好。

3.2 样品的前处理

称取4份等质量的阿司匹林，分别用1%冰醋酸的甲醇溶液（《中华人民共和国药典》中采用）、甲醇溶液、乙腈溶液、磷酸∶乙腈∶水=2∶400∶600（v/v/v）混合液制备供试品溶液[12-15]，分别放置0、24 h，进样，记录色谱图。结果：在0 h时，各溶剂制备的供试品溶液中阿司匹林峰面积无差异，且基本无水杨酸峰；放置24 h后，均出现水杨酸峰，乙腈制备的供试品溶液中水杨酸峰面积最小。这表明阿司匹林乙腈中的水解速度较慢，故选择乙腈溶解样品。

3.3 检测波长的选择

配制浓度为50 μg/ml的阿司匹林、水杨酸对照品溶液，在190～400 nm范围内扫描，记录阿司匹林、水杨酸紫外吸收曲线。结果显示，阿司匹林在310、276、229、197 nm处有较大吸收，水杨酸在202、237、305 nm处有较大吸收。水杨酸在202、237 nm处吸收强度远远大于305 nm处，阿司匹林在276、229、197 nm处吸收强度远远大于310 nm处，见图2。考虑200 nm附近为溶剂末端吸收波长，故237 nm可作为水杨酸的检测波长。另阿司匹林在阿司匹林类药物中为主要有效成分，且在237 nm附近也有较高吸收，故最终选择237 nm为检测波长。

图2 阿司匹林和水杨酸紫外吸收曲线

3.4 柱温的选择

本研究考察了不同柱温（20、25、30、35℃）条件下各组分的分离及响应情况。结果发现，当柱温≥25℃时，阿司匹林和水杨酸均有较好的分离及响应。考虑温度过高可能会加速阿司匹林水解，故选择25℃柱温条件。

3.5 方法比较

采用《中华人民共和国药典》阿司匹林片质量标准下游离水杨酸、含量测定项测定阿司匹林、水杨酸含量（批号：20211014、20211015、20212201），3批阿司匹林含量分别为99.7%、99.6%、99.6%，水杨酸含量分别为0.13%、0.14%、0.13%；经比较两种方法结果一致。

综上所述，本研究建立的高效液相色谱法，采用乙腈直接溶解样品，同时测定阿司匹林片中阿司匹林和水杨酸含量。该方法较《中华人民共和国药典》方法比较，操作更简便，能很好分离阿司匹林和水杨酸，并准确测定其含量，与药典方法比较结果一致。