花生氮敏感品种及评价指标的筛选

高 宇 ，曾瑞儿，姚苏哲，王 迎，黄子珺，李 洁，高恒宽，刘仕元，张 慧，陈婷婷，张 雷

(华南农业大学 农学院/广东省植物分子育种重点实验室, 广东 广州 510642)

氮是植物生长发育必需的大量元素之一，影响植物生长发育的许多方面，尤其是对叶绿素合成、光合作用以及干物质的积累与分配有着至关重要且不可替代的作用[1]。

中国是全球最大的氮肥生产国和消费国，在占世界7%的耕地上消耗了全球35%的氮肥。作为世界上粮食安全压力最大的国家，中国自20 世纪90 年代成功地实现了粮食基本自给，氮肥在其中发挥了巨大的作用[2]。但近期大量研究证明，氮肥用量已经超过了作物的需要，在经济作物体系中，尤其是大田作物，氮肥施用过量已是普遍现象[3-5]。目前，我国的氮肥生产量和消耗量居世界首位，不合理施氮和过量施氮问题严重。实际生产中，作物对氮肥的需求量很难精确，而且由于“施氮量越大作物的产量越高”错误思想的影响，农民往往施用远超过作物需求的氮肥。过量的氮肥施用导致其利用率较低[6-8]。

作物的氮素营养一般来源于土壤和肥料，但花生等豆科作物能根瘤固氮，依赖根瘤、土壤、人工施肥三者提供氮素，三者之间既互相关联又相互制约[9-10]。长期大量氮肥的投入不仅使得花生氮素利用效率降低，同时也抑制了自身的固氮能力，直接影响花生产量的提高和粮食安全[11]。因此，在保持花生高产和优质的同时降低氮肥施用量至关重要，对降低农业生产成本、促进农业可持续发展、保护生态环境具有重要意义。近年来，越来越多的学者聚焦氮高效品种的筛选和推广，旨在通过提高花生氮素利用效率来降低氮肥施用量、稳定产量，进而缓解过量施氮造成的一系列问题[12]。

本试验通过研究81 份花生品种的19 项与花生氮效率相关的指标，通过主成分分析与聚类分析，筛选出花生对氮肥最敏感的指标以及氮敏感型与氮不敏感型花生品种，为后续花生氮高效品种的筛选与培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验于2021 年在广东省广州市增城区华南农业大学宁西教学科研基地进行，试验地位于23°24′N、113°64′E，属于亚热带季风气候，气温高、雨水光照充足、夏季长、霜降期短，年平均降水量1 800 mm，年平均气温22.0～28.0 ℃。试验地前茬作物为水稻，土壤类型为红壤土，耕作层0～20 cm，pH 4.85～5.16；土壤养分状况：有机质 12.38～19.47 g/kg，碱解氮92.26～119.95 mg/kg，速效磷54.18～60.45 mg/kg，速效钾187.42～227.56 mg/kg。

1.2 供试材料

试验材料为81 份来自世界各地的花生品种。

1.3 试验设计

大田试验设低氮和正常施氮2 个处理，正常施氮处理施用尿素225 kg/hm2，低氮处理施用尿素0 kg/hm2。起垄栽培，垄距100 cm，垄面宽85 cm，垄上3 行花生，行距33 cm，株距15 cm，每穴1 粒，每小区20 穴，共20 株。播种前施150 kg/hm2P2O5(对应过磷酸钙1 250 kg/hm2)和150 kg/hm2K2O(对应氯化钾250 kg/hm2)，所有肥料均作为基肥一次性施入。3 月初播种，7 月初收获，水分管理及病虫草害等管理防治措施同当地要求。

1.4 植株性状调查及干质量测定

于花生收获期每小区随机选取5 株长势一致的花生植株进行考种，按照《花生栽培观察记载技术规范》[13]进行考种，指标包括主茎高、主茎节数、主茎粗、侧枝长、分枝数、百果质量、百仁质量、百果仁质量、总果数、单株生产力等产量与产量构成指标。考种完的花生植株分成根、茎、叶和荚果，在105 ℃杀青20 min，然后在75 ℃烘干至恒质量，最后使用精度为0.01g 的电子秤测定不同部位干质量并计算总干质量。

1.5 叶绿素含量的测定

于花生苗期每小区随机选取3 片大小、颜色一致的功能叶进行叶绿素a、叶绿素b 以及类胡萝卜素含量的测定。采用二甲基亚砜(DMSO)浸提法，用打孔器取新鲜叶片约0.2 g(避开主叶脉)，放入7 mL DMSO 原液的试管中(试管最好用磨口玻璃塞密封，以免液体挥发影响测定结果)，置于60 ℃恒温水浴条件下避光浸提一定时间(由15 min 至几小时，根据植物叶片厚度和角质化程度而定)，直至用肉眼观察叶片颜色变白为止。叶绿素被DMSO浸提干净后，把浸提液倒入刻度试管。叶片用DMSO 洗涤2 ～ 3 次，洗液一并倒入刻度试管，最后用DMSO 定容到10 mL。然后取200 μL DMSO 叶绿素浸提液于酶标板中，用酶标仪测定D470nm、D649nm和D665nm。

1.6 数据处理与分析

氮响应系数(Nitrogen response coefficient，NRC)：

不同花生品种各综合指标的隶属函数值：

各综合指标的权重：

各花生品种综合氮敏感指数大小：

式中，Xj表示第j个综合指标；Xmin表示第j个综合指标的最小值；Xmax表示第j个综合指标的最大值；wj表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度即权重；Pj为各花生品种第j个综合指标的贡献率；D为各花生品种在不同氮处理下由综合指标评价所得的氮敏感性综合评价值。

2 结果与分析

2.1 花生各性状氮响应系数主成分分析

以81 份花生品种19 项指标氮响应系数为原始数据，利用SPSS 降维分析中的因子分析，抽取大于1 的特征值得出各主成分的贡献率、成分矩阵及特征向量矩阵。由表1 得出，因子分析提取了6 个主成分，其贡献率分别为第1 主成分19.955%，第2 主成分19.358%，第3 主成分12.361%，第4 主成分8.767%，第5 主成分7.656%，第6 主成分5.596%，累计贡献率73.694%，说明可以解释原始数据73.694%的总变异，可以代替绝大多数指标做一个概括。因此，选择前6 个主成分，将原来的19 个单项指标组合为6 个新的互相独立的综合指标，由此来代表原始19 个指标携带的大部分信息。

表1 各综合指标的贡献率及特征向量1)Table 1 Contribution rate and eigenvector of each composite index

特征向量矩阵能够反映出各个指标在每个主成分当中的载荷，在第1 主成分当中，单株生产力(0.848)、果干质量(0.846)、单株果数(0.783)和总干质量(0.636)的特征向量较大，起主要作用，解释为花生产量性状因子；在第2 主成分当中，总叶绿素含量(0.800)、叶绿素a 含量(0.756)、类胡萝卜素含量(0.738)和叶绿素b 含量(0.705)的特征向量较大，起主要作用，解释为花生光合色素含量因子；在第3 主成分当中，百果质量(0.704)、百果仁质量(0.681)和百仁质量(0.635)的特征向量较大，起主要作用，解释为花生产量构成因子；在第4 主成分当中，茎干质量(0.684)和主茎高(0.646)的特征向量较大，起主要作用，解释为花生茎秆性状因子；在第5 主成分当中，侧枝长(0.667) 和主茎节数(0.573)的特征向量较大，起主要作用，解释为花生株型因子；在第6 主成分当中，叶干质量(0.624)、主茎粗(0.556)和根干质量(0.384)的特征向量较大，起主要作用，解释为花生干物质转移因子。根据各主成分贡献率大小及各指标在不同主成分中的特征向量，得出总叶绿素含量(29.146%)、叶绿素a 含量(28.501%)、单株生产力(27.811%)和总干物质积累(27.458%)所占比例最大，表明叶绿素含量、单株生产力和干物质积累最能代表不同类型花生品种对氮素的响应情况。

2.2 氮敏感花生品种的筛选

用上述主成分分析抽取的6 个综合指标作为评价花生氮敏感性的基础值，利用公式(2)分别计算81 份花生品种的隶属函数值u(Xj)。对于同一个综合指标如第1 主成分而言，编号47 的花生品种u(Xj)最大，为1.000，表明此品种在第1 主成分表现为氮敏感性最强，而编号44 的花生品种u(Xj) 最小，为0.000，表明此品种在第1 主成分表现为氮敏感性最弱。然后根据6 个综合指标的大小，利用公式(3)求出其权重，最后利用公式(4)计算花生品种综合氮敏感性评价指标(D)，D越大说明该花生品种的氮敏感性越高。以上述所得的综合评价指标(D) 作为原始数据，采用欧式距离平方法和Word最小方差法进行聚类分析，将81 份供试花生品种分为氮敏感型(Ⅰ类)、中间型(Ⅱ类)和氮不敏感型花生品种(Ⅲ类)(表2)。

表2 供试花生品种氮敏感等级及分类1)Table 2 Nitrogen sensitivity level and classification of peanut cultivars under test

对聚类出的3 种类型花生进行氮敏感性评价，通过对比6 个主成分的平均隶属函数值，u(X1)和u(X2) 的平均值在不同类型花生品种间差异显著(表2)，其余4 个均无显著差异。某一主成分的u(Xj)值越大说明该类型花生在该主成分的氮敏感性越强，氮不敏感型(Ⅲ类) 花生品种u(X1) 和u(X2) 的平均值最小，氮敏感性最低；中间型(Ⅱ类) 花生品种的u(X1) 和u(X2) 的均值为0.165 和0.369，氮敏感性介于氮敏感型(Ⅰ类)花生品种和氮不敏感型(Ⅲ类) 花生品种之间；氮敏感型(Ⅰ类) 花生品种的u(X1) 和u(X2) 的平均值最高，说明其产量及产量构成因素和叶片光合色素含量对氮肥的敏感性最强。

2.3 不同氮敏感型花生品种农艺性状的差异

由图1A～1E 可得，施氮对不同氮敏感型花生品种的主茎高无显著影响，对主茎节数、侧枝长、分枝数与主茎粗表现出了不同程度的影响。相较于氮不敏感型(Ⅲ类)花生品种来说，正常施氮可以显著提高氮敏感型(Ⅰ类)品种的主茎节数、侧枝长及分枝数和中间型(Ⅱ类)花生品种的侧枝长、分枝数及主茎粗。与低氮处理相比，正常施氮处理仅显著提高了氮敏感型(Ⅰ类)花生品种的分枝数(32.53%)，虽然对其主茎高、主茎节数及侧枝长没有达到显著影响，但相较于低氮处理也分别增加了17.86%，33.04% 和21.25%；而正常施氮处理对中间型(Ⅱ类)和氮不敏感型(Ⅲ类)花生品种的农艺性状影响较小。由此可以说明氮不敏感型花生品种的农艺性状受氮肥影响较小，而氮肥对氮敏感型花生品种的株型结构影响较为明显。

图1 施氮对不同氮敏感型花生品种农艺性状、产量及构成因素的影响Fig. 1 Effect of nitrogen application on agronomic traits, yield and composition factors of peanut cultivars with different nitrogen sensitivities

2.4 不同氮敏感型花生品种产量及构成因素的差异

由图1F～1J 可得，施氮对不同氮敏感型花生品种的单株产量、总果数、百果质量、百仁质量和百果仁质量表现出了不同程度的影响趋势。相较于氮不敏感型(Ⅲ类)花生品种来说，正常施氮可以显著提高氮敏感型(Ⅰ类)花生品种的单株产量、总果数、百果质量及百果仁质量和中间型(Ⅱ类)花生品种的单株产、百果质量、百仁质量及百果仁质量。与低氮处理相比，不同氮敏感型的花生品种在正常施氮处理下的百果质量、百仁质量与百果仁质量均无显著变化，仅在单株生产力及总果数上表现出了不同程度的变化趋势。虽然百果质量、百仁质量、百果仁质量在氮肥处理间没有达到显著差异，但氮敏感型(Ⅰ类)和中间型(Ⅱ类)花生品种的产量在正常施氮处理下显著提高，与低氮处理相比分别提高了189.50%和30.40%，且氮敏感型(Ⅰ类)花生品种的总果数在正常施氮处理下也显著提高了120.80%。

百果质量与单株结果数是决定花生产量的2 大关键因素。因此在百果质量差异不显著的情况下，氮不敏感型(Ⅲ类)花生品种产量受施氮影响较小是因为其单株结果数在低氮处理下就能维持较高水平，而氮敏感型(Ⅰ类)花生品种的单株结果数在施氮处理下显著提高，从而使得产量大幅上升。

2.5 不同氮敏感型花生品种干物质积累状况的差异

由图2A～2E 可得，施氮对不同氮敏感型花生品种的根干质量和叶干质量无显著影响，对果干质量、茎干质量及总干质量表现出了不同程度的影响趋势。相较于氮不敏感型(Ⅲ类)花生品种来说，正常施氮可以显著提高氮敏感型(Ⅰ类)花生品种的果干质量、茎干质量及总干质量和中间型(Ⅱ类)花生品种的果干质量及总干质量。与低氮处理相比，不同氮敏感型的花生品种在正常施氮处理下各部位及总干物质积累均表现出了不同程度的变化趋势。正常施氮显著提高了氮敏感型(Ⅰ类)花生品种的果干质量(202.92%)、根干质量(55.03%)、茎干质量(59.61%)、叶干质量(114.80%) 和总干质量(100.78%)；也显著提高了中间型(Ⅱ类)花生品种的果干质量(30.52%)、叶干质量(50.44%)和总干质量(26.53%)。

图2 施氮对不同氮敏感型花生品种干物质积累和苗期光合色素含量的影响Fig. 2 Effect of nitrogen application on dry matter accumulation and seedling photosynthetic pigment contents of peanut cultivars with different nitrogen sensitivities

干物质积累是荚果产量形成的基础，尤其是生育后半期的干物质积累会显著影响产量。相较于氮不敏感型(Ⅲ类)花生品种，氮敏感型(Ⅰ类)和中间型(Ⅱ类)花生品种的叶干质量、总干质量和果干质量受施氮处理影响较大。

2.6 不同氮敏感型花生品种苗期叶片光合色素含量的差异

由图2F～2J 可得，施氮对不同氮敏感型花生品种的叶绿素b 含量没有显著影响，对叶绿素a 含量、总叶绿素含量和类胡萝卜素含量表现出了不同程度的影响趋势。与中间型(Ⅱ类)和氮不敏感型(Ⅲ类)花生品种相比，正常施氮可以显著增加氮敏感型(Ⅰ类)花生品种苗期的叶片叶绿素a 含量、总叶绿素含量和类胡萝卜素含量。与低氮处理相比，正常施氮处理对中间型(Ⅱ类) 和氮不敏感型(Ⅲ类) 花生品种苗期叶绿素a 含量、叶绿素b 含量、总叶绿素含量和类胡萝卜素含量无显著影响，但可以显著增加氮敏感型(Ⅰ类)花生品种苗期的叶片叶绿素a 含量、总叶绿素含量和类胡萝卜素含量。说明正常施氮处理对氮敏感型(Ⅰ类)花生品种前期的叶绿素含量的提升作用显著高于中间型(Ⅱ类)和氮不敏感型(Ⅲ类)花生品种。

2.7 不同花生品种各性状氮响应系数的相关性分析

对花生品种19 个性状的氮响应系数进行相关性分析，由表4 可知大多数性状间的相关性都达到了显著或极显著水平。在正常施氮处理下，产量分别与单株果数、总干质量和分枝数呈极显著相关，与根干质量和茎干质量呈显著相关。干物质尤其是生育后半期的积累是荚果产量形成的基础，并且花生干物质在不同器官中的分配也会显著影响产量。分枝数等株型因子不仅直接影响叶片的有效光合面积，而且还会影响冠层结构内部水分、光照、CO2、温度等环境，最终影响群体的光合效率和作物产量。说明施氮主要通过影响花生干物质积累与分配及株型结构进而影响花生荚果产量的形成。

表4 不同花生品种各性状氮响应系数间的相关性矩阵1)Table 4 Correlation matrix between nitrogen response coefficients of different peanut cultivars for each trait

3 讨论与结论

氮素是限制作物生长和产量形成的重要元素，增施氮肥可以提高花生的光合能力、氮素积累、总生物量和荚果产量，但会降低其氮素利用效率，影响花生的新陈代谢。想要实现作物高产和农业生产中的减肥减量，就必须在优化氮肥施用量的同时提高氮肥利用率，保障作物的产量和品质[14-15]。而选育氮高效品种，提高作物氮肥利用效率，在保障作物产量和品质的前提下降低氮肥施用量，则是解决过量施氮和肥料利用率低下等问题的有效途径之一[16-17]。当下培育和筛选作物不同氮响应基因以及研究氮高效的基因已经成为国内外的研究热点之一，更有人将氮素高效利用的研究称为“第二次绿色革命”。

评价作物氮敏感性的指标有很多，其中多为叶绿素含量、干物质积累及氮素积累等，但对于不同作物的氮敏感性评价指标尚未统一。因为筛选指标受作物类型、土壤环境及筛选时期的影响有较大差异。目前，水稻、马铃薯、油菜、玉米、棉花等作物氮高效品种筛选试验方法与相关指标构建体系已经较为成熟[18-21]。花生作为豆科植物还具有根瘤固氮功能，对氮素吸收与利用的机理更为复杂，迄今为止相关研究报道较少。本试验参照前人的筛选体系和研究方法，结合花生自身生长发育特点，对81 份花生品种的19 项相关指标的氮响应系数进行主成分分析及聚类分析，将81 份花生品种分为氮敏感型(13)、中间型(33)及氮不敏感型(35)，并得到苗期叶绿素含量、收获期分枝数和干物质积累为花生氮敏感型品种筛选指标。叶绿素是重要的光合色素，是光合作用的基础，而氮素作为花生生长发育所需的大量元素之一，与花生优质高产紧密相关，作为合成叶绿素的重要元素影响叶片的光合作用进而影响碳水化合物的积累，同时也影响相关碳氮代谢酶的活性。由于花生具有根瘤固氮功能，其叶绿素含量随生育时期的推迟对氮肥的需求减少而越来越小，所以在实际生产中可以通过观察花生苗期的叶色来初步判断其对氮肥的敏感性。氮素利用效率是评价作物氮高效品种的重要指标，但花生作为豆科植物，其氮素来源除土壤和肥料外还有根瘤固氮，不同花生品种最适宜的氮肥浓度差异较大，因此，花生的氮高效品种筛选指标应选取受氮肥水平影响较小的氮素收获指数；在适宜的施氮范围内，干物质积累与氮素积累呈显著正相关[22]，所以干物质积累可以在很大程度上反映作物的氮素积累，且较直接测定氮素积累而言更容易实现。在水稻、小麦、玉米、番茄、棉花和马铃薯等作物中也筛选出了叶绿素含量、干物质积累等作为氮高效品种的筛选指标[23-28]。以上指标获取方法较为简单且客观，受人为主观因素影响较小；其次评价指标是通过科学严谨的筛选方法得出，可以为今后作物氮敏感性评价提供理论依据。