大豆核心种质籽粒铁、锌含量精准鉴定及相关性分析

贾 佳 ，汪 欢，段明明，陈 博，程艳波，年 海

(华南农业大学 农学院/国家大豆中心 广东分中心, 广东 广州 510642)

大豆Glycinemax起源于5 000 多年前的古中国，有报告预测，2022/2023 年度世界大豆产量预计为3.91 亿t[1-2]。大豆具有很高的营养价值，富含蛋白质、维生素、矿质元素和很多生物活性物质等，以其为原料产生的种类繁多的豆制品在许多亚洲国家的饮食中扮演着重要角色[3-5]。在过去25 年里，随着世界各国人民对大豆营养价值的认识，豆制品的消耗也在急剧增加[6]。随着大豆在全球饮食结构中越来越受到重视和对其研究的深入，科学家们在致力于提升大豆产量的同时，也日益注重提升大豆籽粒的营养品质[7-8]。

人类赖以生存的矿质元素有22 种以上，铁、锌等微量元素对人体健康不可或缺，在人体新陈代谢和生物化学功能中占据着重要地位[9]。由微量元素的摄入不足导致的营养不良问题长期影响着人类的健康，这种现象被称为“隐性饥饿”[10-12]。全球超过30 亿人因为食物中铁、锌含量摄入不足而遭受各种健康问题[13]。铁和锌是许多关键酶的辅助因子，参与人体很多代谢过程。例如，含铁酶参与氧化代谢和类固醇激素合成和电子传递，除了作为许多酶的辅助因子外，铁还是载氧血红蛋白的主要成分[14]375-392。而含锌酶在碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸的生物合成和降解中发挥重要作用[14]393-408。人体摄入铁、锌含量不足会导致人体生长缓慢和发育不良，造成视力和免疫能力下降，还会影响人体的生殖功能，甚至会导致死亡[15]。

随着对“隐性饥饿”问题越来越重视，铁、锌强化作物也越来越多。目前，国内外已筛选、培育出多种铁、锌强化品种。如国际水稻所选育出高铁水稻品种IR68144-3B-2-2-3，其糙米铁质量分数达到21 mg·kg-1[16]。2014 年，印度审定了6 个高锌含量的小麦品种(BHU1、BHU3、BHU5、BHU6、BHU7 和BHU8)，2015 年在巴基斯坦，4 个籽粒高锌含量的小麦品种也被审定(NR419、NR42、NR421 和Zincl)；扁豆Lablabpurpureus属于旱地作物，近些年来，已有15 个高铁、锌含量的扁豆被国际旱地农业研究中心先后在孟加拉、印度等国审定[17]。在我国，相继有高锌含量的小麦、富铁水稻、富铁玉米、铁锌强化小麦等品种被审定及推广[18]。这些铁、锌强化作物的培育，在缓解微量元素营养不良方面取得了实质性进展。

铁、锌在不同作物中含量相差甚远。我国小麦籽粒铁质量分数平均约为45.4 mg·kg-1，锌质量分数平均约为30.4 mg·kg-1[19-20]，水稻籽粒中铁、锌质量分数分别约为17.69 和21.5 mg·kg-1[21-22]。然而在大豆中，董慕新等[23]测定了来自我国大豆主要8 省产区的90 份大豆籽粒中的铁、锌含量，发现我国8 省产区中大豆籽粒的平均铁、锌质量分数分别为93 和41 mg·kg-1，且不同品种的铁、锌含量存在较大差异，因此筛选、培育出富铁、锌大豆种质意义重大。

增加作物可食用部分中微量元素的含量是解决这些问题的一种比较有效的方法，被称为“生物强化”。通过作物生物强化来提高大豆籽粒中铁、锌含量，从而应对“隐性饥饿”，是一个可行且高效的办法[24]。本研究连续2 年(2 0 1 9—2020)在我国华南地区进行试验，种植了163 份来自不同国家和地区的大豆核心种质并在成熟期收获，通过测定籽粒中铁、锌含量及数据分析，得到大豆籽粒铁、锌含量的基本变异信息与分布规律，以期为优化大豆微量元素营养品质提供理论支持与参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

来自国内外不同地区农艺性状优良的163 份大豆核心种质，由国家大豆改良中心广东分中心提供，编号和名称见表1。

表1 163 份大豆种质的编号与名称Table 1 Number and name of 163 soybean accessions

1.2 主要仪器和试剂

电热鼓风干燥箱(上海一恒)，植物样品粉碎机(百信)，万分位电子天平(岛津)，HYP-340 消化炉(上海纤检)，铁、锌空心阴极灯(岛津)，火焰原子吸收光谱仪(岛津)。铁、锌标准溶液购于国家标准物质中心，优级纯高氯酸、优级纯硝酸，试验用水为超纯水。

1.3 试验设计

163 份大豆种质分别于2019 年和2020 年6 月底种植于广州市华南农业大学试验教学基地(23.17°N，113.37°E)。试验用地均选择肥力均匀、土壤结构一致和地势平坦的地块。试验采用随机区组排列，小区畦宽2.50 m，畦长50.00 m，行株距为50 cm × 10 cm，单粒播种，每份材料种植3 行重复。严格参照热带亚热带夏大豆区域试验管理方法进行田间管理[25]，待大豆处于完熟期(R8)后按品系收获豆荚，脱粒后晒干保存。

1.4 试验方法

1.4.1 籽粒铁、锌含量测定 每个材料挑选100 粒饱满且无病害的种子，清洁干净后放入恒温干燥箱内37 ℃充分干燥，随后使用粉碎机磨成粉末，过100 目筛，暂存4 ℃冰箱备用，消化前将豆粉统一干燥。

籽粒铁、锌含量测定采用浓硝酸-高氯酸湿法消解法[26-27]。具体过程：准确称取0.500 0 g 豆粉(精确至 ± 0.000 5 g)加入到消化管中，加入现配的混合酸(HNO3∶HCIO4体积比＝4∶1) 10 mL，避光静置冷消化12 h。把消化管置于消化炉上，120 ℃进行消煮，1 h 后温度调至240 ℃，待到有白烟产生时，将温度调至280 ℃，直到管内白烟散尽，此时溶液呈无色澄清透明状或者微带黄色，预示着样品已充分消化。取下消化管，静置冷却(此时体积大约为1 m L)。将消化管中的溶液转移到5 0 m L容量瓶中，期间使用超纯水进行3～4 次润洗，以确保消化样品全部转移，并定容到50 mL，摇匀，室温下静置，准备进行微量元素的测定。为了验证试验的准确性，每次消化过程设置2 个空白对照。

1.4.2 仪器工作条件 本试验中，铁和锌元素的测量均使用空气–乙炔火焰原子吸收分光光度法，用一定浓度的铁、锌元素标准样品(试验样品浓度范围内)上机测试并调试仪器，从而得到最适测定参数，工作条件如表2。

表2 仪器工作条件Table 2 Working conditions of instrument

1.4.3 标准曲线的绘制 根据表2 火焰原子吸收仪的参数操作，分别配置一定浓度梯度(试验样品浓度范围内)的铁、锌标准溶液并进行检测，然后绘制元素的标准曲线，如图1 所示：

图1 铁和锌元素的标准曲线Fig. 1 Standard curves of Fe and Zn elements

1.5 数据统计与处理

将测定结果依次录入到Excel 2016 表中，同一样品3 次测量值取平均值得到最终单个环境对应的表型数据。利用SPSS 22.0 对各个环境的表型数据进行描述性统计、Kolmogorov-Smirnov 正态性分布检验(K-S 检验) 和方差分析，使用GraphPad Prism 8 软件对数据进行频率分布直方图绘制，使用Origin 22 对表型数据进行Pearson 相关性分析。采用K-S 检验法，用(X- 1.281 8S)、(X- 0.524 6S)、(X+ 0.524 6S)和(X+ 1.281 8S)这4 个点将性状分为5 级，其中X、S分别代表性状的平均值和标准差[28-29]。

2 结果与分析

2.1 大豆籽粒表型数据统计分析

利用火焰原子吸收光谱仪测定了163 份大豆核心种质籽粒的铁和锌含量。对籽粒铁、锌含量描述性统计分析结果见表3，由表3 可知，2019 年不同来源大豆种质籽粒铁质量分数变化范围为71.02～147.91 mg·kg-1，平均为97.17 mg·kg-1，2020 年大豆籽粒铁质量分数变化范围为90.19～159.92 mg·kg-1，平均为117.02 mg·kg-1；2019 年不同来源大豆种质籽粒锌质量分数变化范围为34.62～53.11 mg·kg-1，平均为42.41 mg·kg-1，2020 年大豆籽粒锌质量分数变化范围为36.32～51.47 mg·kg-1，平均为43.41 mg·kg-1。2019 年籽粒铁、锌质量分数的变异系数最大，分别为16.49% 和8.21%，但从两者整体比较来看，籽粒锌含量的变化较小。此外，从单因素方差分析可知，不同年份下，163 份大豆种质籽粒铁、锌含量均存在明显差异(P＜0.05)。

表3 不同年份163 份大豆种质籽粒铁、锌含量的描述性统计Table 3 Descriptive statistical of grain Fe and Zn content in 163 soybean accessions in two years

通过数据整体分布可知，2019 年籽粒铁含量的偏度绝对值大于1，除此之外，2020 年籽粒铁含量以及2019 和2020 年籽粒锌含量的偏度和峰度的绝对值都小于1；经过K-S 检验分析得知，除2019 年籽粒铁含量差异性显著的检验值(Sig.值)小于0.05 外，其余年份下铁、锌含量表型Sig.值都大于0.05，表明除2019 年籽粒铁含量外，都符合正态分布，这些结果与偏度、峰度的结果相一致。结合籽粒铁、锌含量频率分布直方图(图2)可知，2019 年中籽粒铁含量呈现一定程度的偏左移偏态分布，但分布形态仍符合正态分布，结合数量性状的遗传特点，这一特别情况仍可当做正态分布进行后续分析。

图2 2019—2020 年163 份大豆种质籽粒铁、锌含量频率分布直方图Fig. 2 Histogram of frequency distribution of grain Fe and Zn contents of 163 soybean accessions in 2019 and 2020

2.2 大豆籽粒铁、锌含量间相关性分析

利用Origin 22 对不同种质来源及种植年份的大豆籽粒铁、锌含量进行相关性分析。结果(图3)表明，总计的15 对相关系数均表现为正相关，相关性达显著的有11 对(P＜0.05)，占总数的73.33%。2019 年籽粒铁含量与2020 年籽粒铁含量、铁平均含量、2019 年籽粒锌含量、2020 年籽粒锌含量和锌平均含量的相关系数分别为0.13、0.78、0.30、0.17 和0.29；2020 年籽粒铁含量与铁平均含量、2019 年籽粒锌含量、2020 年籽粒锌含量和锌平均含量的相关系数分别为0.70、0、0.14 和0.079；铁平均含量与2019 年籽粒锌含量、2020 年籽粒锌含量和锌平均含量的相关系数分别为0.21、0.18 和0.24；2019 年籽粒锌含量与2020 年籽粒锌含量和锌平均含量的相关系数分别为0.35 和0.88；2020 年籽粒锌含量与锌平均含量的相关系数为0.74。由相关分析可以看出，大豆籽粒铁含量越高，伴随着籽粒锌含量也高，说明籽粒铁含量和锌含量的吸收有一定的相互促进作用，进一步说明大豆籽粒铁和锌的含量积累可能具有相似的相关遗传机制[30]。

图3 2019—2020 年163 份大豆种质籽粒铁、锌含量相关性分析Fig. 3 Correlation analyses of grain Fe and Zn contents of 163 soybean accessions in 2019 and 2020

2.3 大豆籽粒铁、锌含量概率分级

根据K-S 检验法，按照(X- 1.281 6S)、(X- 0.524 4S)、(X+ 0.524 4S)、(X+ 1.281 6S)这4 个分割点将不同种质来源及种植年份的大豆籽粒铁、锌含量性状从低到高顺序各分为5 个等级，以1、2、3、4 和5 级表示，其分别代表极低、低、中、高和极高，性状划分等级标准可以用来筛选评价大豆种质，性状表现极高品系可作为大豆育种利用的基础亲本材料。

根据分级标准计算得出了各级分界点和每一级相应的具体大豆种质数量(表4)。由表4 可知：2019 年，163 份大豆种质中，铁质量分数 ＜ 76.64 mg·kg-1为1 级(极低)，代表种质有粤春2015-2、莆豆8008、桂春16 号等共7 份，铁质量分数 ＞ 117.70 mg·kg-1为5 级(极高)，代表种质有华春1 号、BX17、贡夏8173 等共22 份；2020 年，铁质量分数 ＜100.36 mg·kg-1为1 级(极低)，代表种质有华夏16、莆豆5 号、华夏25 等共15 份，铁质量分数 ＞133.68 mg·kg-1为5 级(极高)，代表种质有桂早1 号、BX17、莆豆704 等共16 份。2019 年，163 份大豆种质中，锌质量分数 ＜ 37.95 mg·kg-1为1 级(极低)，代表种质有瓦窑黄豆、桂春1 号、桂春5 号等共17 份，锌质量分数 ＞ 46.87 mg·kg-1为5 级(极高)，代表种质有桂夏7 号、桂1701、赣豆7 号等共14 份；2020 年，锌质量分数 ＜ 39.49 mg·kg-1为1 级(极低)，代表种质有中豆41、冀豆12、桂春16 等共16 份，锌质量分数 ＞ 47.33 mg·kg-1为5 级(极高)，代表种质有赣豆7 号、中黄24、华春3 号等共16 份。从整体来看，不同年份163 份大豆种质铁、锌含量处在概率分级中级的数量均是最多的。

表4 163 份大豆种质籽粒铁、锌含量概率分级1)Table 4 Probability classification of grain Fe and Zn contents of 163 soybean accessionsw/(mg·kg-1)

2.4 籽粒铁、锌含量表现突出的大豆种质筛选

通过2 年大豆籽粒铁、锌含量数据分析和比较可知，大豆籽粒铁、锌含量变异较大，因此鉴定出环境稳定的富铁、锌大豆非常重要。由表5 可知，基于不同种质来源和两年平均铁、锌含量K-S 检验概率分级，粤夏2018-2、BX7 和TGX1803-20E 的籽粒铁含量都处于极高类别，粤春2015-2 的籽粒铁含量都处于极低类别；桂夏豆116、桂夏豆109、贡夏6 973和赣豆7 的籽粒锌含量都处于极高类别，桂春5、Y4 和桂春1 号的籽粒锌含量都处于极低类别。此外，华夏24 和圣豆40 虽然在2020 年其籽粒铁含量不属于极高类型，但是其2019 年和两年平均铁含量均属于极高类型，并且其变异较小，比较稳定，粤春2017-1、桂夏豆117、桂夏7 号和OPEPara4 的籽粒锌含量情况类似；TGX1908-89、S20、莆豆5 号和粤夏2017-2 的籽粒铁含量在2019 年不属于极低类型，但是其在 2020 年和两年的平均铁含量均属于极低类型，且其变异较小和表现比较稳定，而S519/6/14、中豆41 和 Y6 的籽粒锌含量情况类似；桂1701 和桂夏豆109 的两年平均铁、锌含量均属于极高类型，其分别在不同年份中表现突出，属于籽粒高铁高锌含量的双高大豆种质代表；S20、瓦窑黄豆、Y6 和BX5 的两年平均铁、锌含量均属于极低类型，其分别在不同年份中表现突出，属于籽粒低铁、低锌含量的双低大豆种质代表。所以，最终从163 份核心种质中分别筛选到5 份稳定的高铁材料和8 份稳定的高锌材料；5 份稳定的低铁材料和6 份稳定的低锌材料；2 份铁锌含量双高材料和4 份双低材料。

表5 大豆种质籽粒铁、锌含量突出表现材料概要1)Table 5 Summary of soybean accessions with prominent grain Fe and Zn contents

3 讨论与结论

可摄入矿质元素的缺乏是人类正面临着的又一挑战，生物强化可能是一个解决此困境的有效方法。这一过程可以通过普通植物育种和现代生物技术极大地提高主食作物的矿质元素含量，从而对人类健康产生显著的影响[25]。铁和锌在全球公共健康上有一个重要的生物学相关性和临床意义[31]。在人体中，铁是红细胞中血红蛋白的形成所必需的，也是能量代谢所需要的，并且是细胞内电子的传输介质，另外，在各种组织重要的酶系统中，铁有着不可或缺的作用；锌同样有着重要的作用，锌是许多酶结构中的重要组成部分，也是蛋白和遗传物质的形成中所必需的，锌在味觉感知、伤口愈合、精子产生、胎儿正常发育、性成熟和免疫系统健康等方面起着重要作用[3]。

大豆不同种质间籽粒铁、锌含量存在很大的差异。本研究连续两年测定163 份不同来源的大豆核心种质，结果显示，不同年份籽粒铁、锌含量存在显著差异，且呈现偏正态分布，籽粒铁、锌含量间存在显著正相关性。相同品种在不同年份下籽粒铁、锌含量也存在差异。通过概率分布检验分析，分别筛选到5 份稳定的高铁含量、8 份稳定的高锌含量、5 份稳定的低铁含量、6 份稳定的低锌含量、2 份铁锌含量双高和4 份双低含量的大豆代表种质。桂1701 和桂夏豆109 籽粒铁和锌的含量都很高，说明这两个品种自身对铁、锌的吸收能力较强。通过品种改良，提高铁、锌微量元素含量，利于营养功能型大豆新品种选育。桂夏豆109 是由中豆8 号和BX13 杂交育成的夏大豆中熟品种，作为母本的中豆系列品种和作为父本的巴西系列品种都表现出较强的铁、锌富集能力。这些材料都将为华南地区高铁、锌含量大豆品种选育、种质创新以及相关遗传解析提供材料支撑。

作物籽粒中铁和锌的含量同时受自身基因型和环境的交互影响。提高作物籽粒中的铁和锌元素的含量，通常可通过常规育种、分子辅助育种和基因工程等手段来实现。对于常规育种，选定出主干亲本，将控制籽粒高铁、锌含量的基因与其他控制优异农艺性状基因聚合在一起，培育出籽粒高铁、锌含量和产量高等品种，是一种行之有效的办法。例如，高铁水稻品种IR68144-3B-2-2-3 和高铁、高锌小麦品种秦黑1 号就是通过优异亲本杂交而成功选育的[16,32]。本研究所测定的163 份国内外大豆资源中，籽粒铁质量分数变化范围为71.02 ～ 159.92 mg·kg-1，籽粒锌质量分数变化范围为34.62 ～ 53.11 mg·kg-1。说明参试大豆资源籽粒铁、锌质量分数存在丰富的遗传潜力，生产上可根据需要选择不同的大豆资源作为基础亲本材料进行种植或者进行选择育种，育成专有型品种。利用概率分级法分别将大豆籽粒铁、锌质量分数性状分为5 级，即极低、低、中、高和极高，推荐极高品系作为大豆籽粒高铁、高锌含量育种利用的基础亲本材料。

目前我国在大豆的栽培育种上正在积极开展各项工作来提高籽粒矿质元素的积累。大豆含有非常丰富的营养物质和矿质元素，是人体吸收铁和锌元素的重要食物来源[33]，因此分析大豆种质资源籽粒中铁、锌含量可为培育富铁、锌大豆提供重要依据。本研究连续两年在华南农业大学试验基地进行试验，163 份不同来源大豆种质资源籽粒铁、锌微量元素被鉴定。结果表明：大豆籽粒铁、锌元素含量受到基因型和环境的共同影响，相同品系在不同年份下由于气候和降雨等因素从而存在一定的差异，不同品系由于基因型的影响，对环境的敏感程度也不相同。不同来源大豆种质资源间的铁、锌含量也存在显著差异，籽粒铁、锌质量分数变异系数分别为10.48% ～ 16.49%、6.43% ～ 8.21%，表现出丰富的遗传变异。鉴于目前大豆的生产环境，研究大豆的矿质元素含量以及矿质元素之间的关系，筛选出品质性状表现优良的品种是具有科学意义的。