川崎病患儿STAT3-SOCS3信号通路的表达及其对冠状动脉病变的影响

范婉钰 张 旭 王 瑾 郭俊秀 邹瑞瑛 滕懿群

川崎病(Kawasaki disease,KD)是儿童时期最常见的血管炎综合征,主要影响中小动脉,可引起冠状动脉血栓形成、狭窄甚至闭塞,导致心肌梗死[1]。KD的发病机制尚不明确,目前认为与感染、环境、遗传和免疫等多种因素相关。已有研究表明,信号转导与转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)-细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)信号通路参与了KD的发生和发展,但在冠状动脉病变(coronary artery lesion,CAL)形成中所起的作用和机制尚不清楚[2,3]。本研究观察KD患儿外周血单核细胞(peripheral blood monouclear cells,PBMC)中STAT3、SOCS3、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达和和血浆中MMP9、VEGF的水平,并探讨STAT3-SOCS3信号通路对冠状动脉病变(coronary artery lesion,CAL)的影响。

对象与方法

1.研究对象:选取2021年1月～2022年6月在嘉兴市第二医院儿科住院的KD患儿50例为研究对象(KD组)。纳入标准:所有KD患儿均符合日本循环协会的KD诊断标准[1]。所有KD患儿住院期间均接受大剂量静脉注射丙种球蛋白(intravenous immunogloblin,IVIG)和口服阿司匹林治疗。排除标准:①入院前已应用过IVIG治疗者;②住院期间未应用IVIG治疗者;③临床资料不全者。另选取同期在笔者医院进行常规体检的健康儿童30例为健康志愿者(对照组)。所有KD患儿IVIG治疗前均常规行心脏彩超检查评估冠状动脉病变情况,并于IVIG治疗后4周内至少复查2次心脏超声监测冠状动脉的变化。参照冠状动脉病变的诊断和分型标准,根据心脏彩超检查结果将KD患儿分为CAL组与无CAL组[4]。本研究获得了嘉兴市第二医院医学伦理学委员会批准(伦理学审批号:JXEY-2020JX022),研究对象监护人均知情并签署同意书。

2.主要试剂和仪器:Trizol RNA提取试剂盒购自美国Ambion公司,STAT3、SOCS3、MMP9和VEGF引物由安徽通用生物有限公司合成,荧光定量PCR检测试剂盒购自杭州皓丰生物技术有限公司,兔抗人STAT3抗体、SOCS3抗体、MMP9抗体、VEGF抗体、β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG二抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司,ECL发光试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自合肥海伯莱生物技术有限公司,酶联免疫吸附法检测试剂盒购自上海臻科生物科技有限公司。CFX Connect Real-Time System实时荧光定量PCR仪和ChemiDoc XRS凝胶成像仪购自美国Bio-RAD公司,SUNRISE酶标仪购自瑞士TECAN公司。

3.标本采集:分别采集KD组急性期(IVIG治疗前)、缓解期(IVIG治疗后1个月)和对照组的空腹外周静脉血5ml于抗凝管中,加入淋巴细胞分离液分离出PBMC用于mRNA和蛋白表达测定,并收集血浆于-80℃冰箱保存。

4.实时荧光定量PCR法检测STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表达: 采用Trizol法提取PBMC的总RNA,以总RNA为模板反转录合成cDNA。按照说明书进行PCR检测,PCR反应参数为:95℃预变性5min;95℃变性30s;60℃退火30s;72℃延伸30s,共40个循环。STAT3上游引物:5′-CGACCTGCAGCAATACCATTGA-3′,下游引物:5′-ACTCCATGTCAAAGGTGAGGGA-3′;SOCS3上游引物:5′-CAGCTCCAAGAGCGAGTACC-3′, 下游引物:5′-TGACGCTGAGCGTGAAGAAG-3′;MMP9上游引物:5′-ACGCACGACGTCTTCCAGTA-3′,下游引物:5′-CCACCTGGTTCAACTCACTCC-3′;VEGF上游引物:5′-CTT CCC GAG GCA CAG AGA-3′,下游引物:5′-GGG AGG GCAGAG CTG AGT-3′;内参β-actin上游引物:5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′,下游引物:5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′,用2-△△ct法计算目的基因mRNA的相对表达量。

5.Western blot法检测STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表达:首先裂解单核细胞,提取单核细胞总蛋白,BCA法进行蛋白定量,进行 SDS-PAGE,再转印至 PVDF 膜上,用 含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭 1h,分别加入兔抗人SOCS3抗体、STAT3抗体、MMP9抗体、VEGF抗体和β-actin抗体,抗体浓度均为1∶500,4℃ 孵育过夜,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 二抗(1∶5000),室温孵育 2h,洗涤后加入ECL发光试剂盒混合液体,移入凝胶成像分析仪中,化学光敏模式曝光显影。以目的蛋白条带灰度值和内参β-actin的条带灰度值比值反映目的蛋白的表达水平。

6.酶联免疫吸附法检测血浆MMP9、VEGF水平:具体操作步骤按照试剂盒说明书,配置标准品工作液,向反应孔加标准品或待测样品50μl,立即加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl,37℃孵育1h,洗涤5 次,加入底物A、B各50μl,37℃孵育15min,加入50μl终止液,用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(A)值,通过标准曲线计算MMP9、VEGF含量。

结 果

1.一般资料比较:KD组中男患儿29例,女患儿21例,平均月龄为20个月;KD组发热平均持续时间为7天;KD组中37例(74.0%)为完全川崎病,7例(14.0%)对首剂IVIG治疗无反应,总共12例(24.0%)KD患儿并发CAL。对照组中男孩19例,女孩11例,平均月龄为22个月。KD组和对照组性别、月龄比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。

2.KD组急性期、KD组缓解期和对照组PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表达及血浆MMP9、VEGF水平比较:KD组急性期PBMC中STAT3 mRNA、SOCS3 mRNA、MMP9 mRNA、VEGF mRNA表达及血浆MMP9、VEGF水平均高于KD组缓解期和对照组(P<0.05);KD组缓解期PBMC中STAT3 mRNA、SOCS3 mRNA、MMP9 mRNA、VEGF mRNA表达及血浆MMP9、VEGF水平均高于对照组(P<0.05),详见表1。

表1 各组PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表达和血浆MMP9、VEGF水平比较

3.KD组急性期、KD组缓解期和对照组PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表达水平比较:KD组急性期PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表达水平均高于KD组缓解期和对照组(P<0.05);KD组缓解期PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白水平表达均高于对照组(P<0.05),详见表2、图1。

图1 各组PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表达水平比较

表2 各组PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表达水平比较

4.KD患儿CAL组和无CAL组PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表达及血浆MMP9、VEGF水平比较:CAL组PBMC中STAT3 mRNA、SOCS3 mRNA、MMP9 mRNA、VEGF mRNA表达及血浆MMP9、VEGF水平均高于无CAL组(P<0.05),详见表3。

表3 两组PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF mRNA表达及血浆MMP9、VEGF水平比较

5.KD患儿CAL组和无CAL组STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表达水平比较:CAL组PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表达水平均高于无CAL组(P<0.05),详见表4、图2。

表4 两组PBMC中STAT3、SOCS3、MMP9、VEGF蛋白表达水平比较

6.KD组STAT3、SOCS3与MMP9、VEGF的相关性分析:Pearson相关分析结果显示,KD组急性期PBMC中STAT3、SOCS3的mRNA和蛋白表达分别与MMP9、VEGF呈正相关(P<0.05)。

讨 论

KD特征是冠状动脉和其他中等大小动脉广泛的血管炎症,血管内皮细胞的功能障碍和损伤是KD血管炎发生的最初环节。KD患者血清中炎性细胞因子的过度表达增加血管内皮细胞黏附分子的表达,进而促进中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞与血管内皮的黏附,引起血管内皮细胞损伤,随后血管壁基质发生降解,炎性细胞可向血管壁深部扩散,从而导致血管壁结构重建,后期可出现冠状动脉狭窄、冠状动脉瘤[1]。

MMP9属于锌依赖内肽酶家族,可由多种细胞产生,具有特异的胶原酶和弹性蛋白酶活性。MMP9可以降解主要由胶原组织、弹性蛋白和蛋白多糖组成的内皮下层,有助于炎性细胞进入到血管壁深层,与血管壁的损伤和重构关系密切[5]。既往研究显示并发CAL的KD患儿血清MMP9水平明显增加,经过分析发现MMP不仅是并发CAL的危险因素,而且是并发CAL的预测因子[6]。VEGF由血管平滑肌细胞生成,通过结合靶细胞上的受体发挥其生物活性,VEGF不仅可以增加内皮细胞的通透性,还可促进血管内皮细胞增殖和分裂,刺激新血管形成[7]。另外,VEGF还可刺激巨噬细胞和中性粒细胞募集,并诱导产生细胞因子,发挥促炎的作用,既往研究显示,VEGF在KD中表达明显上升,提示VEGF参与了KD的炎性反应过程[8]。

本研究结果显示, KD患儿急性期PBMC和血浆中MMP9、VEGF表达较对照组明显上升,缓解期MMP9、VEGF表达均有不同程度的下降,但两个时期均明显高于对照组,提示MMP9和VEGF参与了KD的病理生理过程。对KD患儿进一步分析发现, CAL组MMP9、VEGF表达明显高于无CAL者,与既往研究结果一致,提示KD患儿MMP9和VEGF表达增加与并发CAL密切相关[9,10]。

STAT3是一种重要的转录因子,被上游细胞因子激活后,其酪氨酸705或丝氨酸727位点发生磷酸化,磷酸化的STAT3进入细胞核通过调控相关下游基因的转录实现细胞因子的信号转导[11]。研究发现在KD患儿和动物模型中STAT3表达上调,提示STAT3及其相关信号通路参与了KD的病理生理过程[3]。SOCS3是由多种细胞因子诱导产生的负性调节蛋白,可反馈性抑制STAT3表达,负性调控细胞因子信号转导[12]。本研究结果显示,KD患儿PBMC中STAT3、SOCS3的表达在急性期达到峰值,在缓解期逐渐降低,但仍高于健康对照组,提示KD患儿STAT3-SOCS3信号通路被激活。

在机体正常状态下,STAT3受到细胞因子诱导后表达上升,可通过上调其靶基因SOCS3的转录对STAT3进行负性调控,进而下调STAT3的表达,维持动态平衡。由于在KD急性期,大量细胞因子持续性存在,细胞因子诱导产生的SOCS3表达增加不能完全抑制细胞因子对STAT3的诱导活化,反馈抑制回路失调,导致STAT3、SOCS3持续过度表达,表现为STAT3-SOCS3信号通路异常活化。有研究表明,MMP9、VEGF是STAT3信号通路的下游因子,STAT3表达升高可上调MMP9、VEGF基因的转录及表达,增强其生物学功能[13,14]。本研究发现,KD患儿PBCM中STAT3、SOCS3的表达分别与MMP9、VEGF呈正相关,提示STAT3-SOCS3信号通路可能通过上调MMP9、VEGF的表达导致CAL。

综上所述,本研究结果显示KD患儿STAT3-SOCS3信号通路被异常激活,可能通过上调MMP9、VEGF的表达导致CAL。但本研究存在一定的局限性,首先由于本研究未使用冠状动脉内径作为判断CAL的依据,可能会对CAL的评估有影响。其次本研究中KD患儿并发CAL的样本量较小,可能会对结论存在一定影响,因此需要进行大样本量多中心研究来验证。本研究仅探讨了STAT3-SOCS3信号通路对CAL的影响,在KD的病理生理过程中,STAT3-SOCS3信号通路可能与其他信号通路相互联系、相互影响,构成调控网络,共同参与CAL的形成,但其详细机制尚需进一步研究予以证实。