急性缺血性脑卒中患者血清Janus 蛋白酪氨酸激酶2 和细胞因子信号转导抑制因子1 水平及其与肠道菌群、免疫功能的关系研究

付楠良，郝婷婷，刘玺昌

急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）是临床常见的脑卒中类型，约占全部脑卒中的60%～80%，具有较高的致残率和死亡率，且随着社会老龄化的进展，其发病率呈不断上升趋势，我国每年新发AIS患者例数超过200万例，这对居民生命安全造成了严重威胁［1-2］。研究显示，炎症反应参与了AIS发病的各个阶段，其会破坏肠道黏膜屏障，造成肠道菌群失调，而肠道菌群失调可能通过细菌代谢产物打破免疫平衡，从而直接或间接地影响AIS的发生发展［3-4］。Janus蛋白酪氨酸激酶（Janus kinase，JAK）2作为Janus家族成员之一，在脑组织中广泛表达，而JAK/信号传导及转录活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路可参与机体氧化应激、炎症反应等的调控，其中JAK2/STAT3信号通路已被证实在缺血性脑损伤中发挥重要作用［5-6］。细胞因子信号转导抑制因子1（suppressor of cytokine singaling 1，SOCS1）作为一种负调控因子可通过JAK2/STAT3、核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）等途径减弱信号传导，进而在炎症反应和免疫应答过程中发挥重要作用［7］。基于此，本研究旨在分析AIS患者血清JAK2、SOCS1水平及其与肠道菌群、免疫功能的关系，以期为AIS的预防和诊治提供数据参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2020年2月至2023年2月宜昌市中心人民医院收治的AIS患者106例为AIS组，其中男56例，女50例；年龄38～79岁，平均（58.1±8.7）岁。纳入标准：（1）符合AIS的诊断标准［8］，且经颅脑CT或MRI检查确诊；（2）首次发病，且发病至住院时间＜24 h；（3）临床资料完整；（4）对本研究知情同意。排除标准：（1）合并恶性肿瘤者；（2）存在其他脑血管疾病者；（3）存在急性或慢性感染者；（4）存在心、肝、肾等重要脏器功能障碍者；（5）合并免疫系统疾病者。另选取同期在宜昌市中心人民医院进行体检的健康者106例为对照组，其中男58例，女48例；年龄36～78岁，平均（57.9±8.6）岁。纳入标准：（1）临床资料完整；（2）对本研究知情同意。排除标准：有颅内手术史。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（χ2=0.076，P=0.783；t=0.168，P=0.866）。本研究获得宜昌市中心人民医院伦理委员会审核批准（批号：2020119203）。

1.2 研究方法

1.2.1 血清JAK2、SOCS1水平测定 抽取AIS患者入院次日晨起及对照组体检当日空腹肘静脉血3～5 ml，3 500 r/min离心15 min（离心半径8 cm），取上清液，采用实时荧光定量PCR法测定血清JAK2、SOCS1水平，具体方法为：采用Trizol试剂提取血清总RNA，将总RNA反转录为cDNA，随后使用PCR仪进行扩增，以GAPDH作为内参基因。PCR总反应体系为20.0 μl，包括SYBR PremixEx Tap 12.5 μl，上、下游引物各1.0 μl，cDNA 2.0 μl，双蒸水3.5 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性600 s，95 ℃变性30 s，60 ℃退火60 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。测定完成后采用2-ΔΔCt法计算JAK2、SOCS1相对表达量，即血清JAK2、SOCS1水平，上述操作重复3次，取平均值。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2 肠道菌群数量测定 取新鲜粪便（无尿液、血液污染）1 g于离心管中，加5 ml蒸馏水后300 r/min离心1 min（离心半径8 cm）；按照10倍连续稀释方式将其稀释至10-8g/ml，取5 μl分别接种至乳酸杆菌培养基、双歧杆菌培养基、伊红美兰平板培养基、肠球菌培养基，于37 ℃恒温条件下培养3 d，分别记录乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠埃希菌、肠球菌数量。

1.2.3 免疫功能指标测定 抽取AIS患者入院次日晨起及对照组体检当日空腹肘静脉血3～5 ml，3 500 r/min离心15 min（离心半径8 cm），取上清液，使用流式细胞分析仪（CYTOMICS FC500，美国贝克曼库尔特公司）测定CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比。

1.3 统计学方法 使用SPSS 25.0统计学软件对所有数据进行分析处理。符合正态分布的计量资料用（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；两变量间的相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清JAK2、SOCS1水平 AIS组血清JAK2水平高于对照组，SOCS1水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组血清JAK2、SOCS1水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum JAK2 and SOCS1 levels between the two groups

表2 两组血清JAK2、SOCS1水平比较（±s）Table 2 Comparison of serum JAK2 and SOCS1 levels between the two groups

注：AIS=急性缺血性脑卒中

组别例数JAK2SOCS1对照组1061.0±0.21.1±0.2 AIS组1061.7±0.30.6±0.1 t值18.69120.007 P值＜0.001＜0.001

2.2 肠道菌群数量 AIS组乳酸杆菌、双歧杆菌数量低于对照组，大肠埃希菌、肠球菌数量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组肠道菌群数量比较（±s，lgCFU/g）Table 3 Comparison of intestinal flora quantity between the two groups

组别例数乳酸杆菌 双歧杆菌 大肠埃希菌 肠球菌对照组1069.2±1.28.8±1.05.3±1.04.6±1.0 AIS组1067.0±1.86.5±1.57.4±2.26.7±1.7 t值10.04213.3569.02811.233 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 免疫功能指标 AIS组CD3+、CD4+z免疫功能指标间的相关性 Pearson相关分析结果显示，AIS患者血清JAK2水平与乳酸杆菌数量、双歧杆菌数量、CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比均呈负相关，与大肠埃希菌数量、肠球菌数量、CD8+T淋巴细胞百分比均呈正相关（P＜0.05）；AIS患者血清SOCS1水平与乳酸杆菌数量、双歧杆菌数量、CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比均呈正相关，与大肠埃希菌数量、肠球菌数量、CD8+T淋巴细胞百分比均呈负相关（P＜0.05），见表5。

表4 两组免疫功能指标比较（±s，%）Table 4 Comparison of immune function indexes between the two groups

表4 两组免疫功能指标比较（±s，%）Table 4 Comparison of immune function indexes between the two groups

组别例数 CD3+ T淋巴细胞百分比CD4+ T淋巴细胞百分比CD8+ T淋巴细胞百分比对照组10668.7±5.246.8±3.624.1±3.5 AIS组10660.1±5.436.2±3.128.1±3.5 t值11.79522.9908.370 P值＜0.001＜0.001＜0.001

表5 AIS患者血清JAK2、SOCS1水平与肠道菌群数量、免疫功能指标间的相关性Table 5 Correlation between serum JAK2 and SOCS1 levels and intestinal flora quantity，immune function indexes in AIS patients

3 讨论

AIS是临床中常见的脑血管疾病，患者多表现为头晕目眩、偏瘫，严重者甚至出现昏迷不醒。随着AIS病情的进展，患者血脑屏障功能被破坏，如果不能得到及时的救治，其生命安全将受到威胁［9］。既往研究显示，免疫应答/炎症反应在AIS的发生发展过程中起着重要作用，其可通过释放大量炎症递质而使缺血部位损伤加重，同时也可释放神经保护因子，进而削弱对神经元的损伤［10］。此外，另有研究显示，肠道菌群在正常情况下处于动态平衡状态，当机体出现炎症反应时肠黏膜屏障被破坏，导致肠道菌群失调，造成肠道细菌/内毒素进入血液循环，引发全身炎症反应，因而肠道菌群在AIS的发生发展过程中发挥着重要作用［4，11］。因此，探寻影响AIS患者肠道菌群及免疫功能的指标，对改善患者病情及预后有重要意义。

JAK2在神经胶质细胞中广泛表达，且JAK2/STAT3信号通路与炎症反应、免疫系统紊乱等密切相关。研究证实，当发生缺血性脑卒中时，JAK2/STAT3信号通路被缺血损伤、炎症因子异常激活并转化为磷酸化状态，从而参与调控细胞增殖、分化及凋亡基因的转录，进而在炎症反应、细胞凋亡等过程中发挥重要作用［12-13］。既往研究显示，当发生脑梗死时，JAK2/STAT3信号通路被激活，主要表现为JAK2、磷酸化JAK2（phosphorylated JAK2，p-JAK2）、磷酸化（phosphorylated STAT3，p-STAT3）表达水平升高，神经功能受损［14］。本研究结果显示，AIS组血清JAK2水平高于对照组，与韩玉惠等［14］研究结果一致，提示AIS患者血清JAK2水平升高，分析原因可能如下：当患者发生AIS时，机体处于氧化应激状态，JAK2/STAT3信号通路被激活，使JAK2、磷酸化STAT3表达水平升高［15］。SOCS1定位于人染色体16p13.13，作为一种负调节因子，其可参与调控免疫反应、炎症反应等［16］。SOCS1在内皮细胞中广泛表达，其可抑制炎症反应，避免血管内皮细胞受损，王薇薇等［17］研究发现，SOCS1可减轻AIS模型小鼠炎症反应。本研究结果显示，AIS组血清SOCS1水平低于对照组，提示AIS患者血清SOCS1水平降低，分析原因可能为：AIS可引发机体免疫应答/炎症反应，使DNA甲基化转移酶活性增加，造成SOCS1异常甲基化，进而使SOCS1基因沉默，导致血清SOCS1水平降低［18］。本研究Pearson相关分析结果显示，AIS患者血清JAK2水平与血清SOCS1水平呈负相关。既往研究发现，SOCS1可与JAK2直接结合，抑制JAK2磷酸化，从而抑制JAK2/STAT3信号通路的激活，进而减轻炎症反应［19］。

肠道菌群被称为“第二大脑”，肠-脑之间是双向的，一侧功能障碍将影响另一侧功能。本研究结果显示，AIS组乳酸杆菌、双歧杆菌数量低于对照组，大肠埃希菌、肠球菌数量高于对照组，提示AIS患者消化功能受损，肠道菌群平衡被破坏。AIS可打破机体免疫平衡状态，引起免疫功能紊乱［20］。本研究结果显示，AIS组CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比低于对照组，CD8+T淋巴细胞百分比高于对照组，提示AIS患者存在免疫功能受损，与上述研究结果［20］一致。本研究Pearson相关分析结果显示，AIS患者血清JAK2水平与乳酸杆菌数量、双歧杆菌数量、CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比均呈负相关，与大肠埃希菌数量、肠球菌数量、CD8+T淋巴细胞百分比均呈正相关；AIS患者血清SOCS1水平与乳酸杆菌数量、双歧杆菌数量、CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比均呈正相关，与大肠埃希菌数量、肠球菌数量、CD8+T淋巴细胞百分比均呈负相关。研究显示，发生AIS时，机体SOCS1水平降低，导致其对JAK2/STAT3信号通路的抑制作用下降，而JAK2/STAT3信号通路的激活可促进诸如IL-1、IL-6等促炎因子的大量分泌，导致肠上皮功能障碍加重，进而使肠道菌群失衡，有益菌减少，有害菌增加，且大量促炎因子还会降低免疫功能［21］。

综上所述，AIS患者血清JAK2水平升高，SOCS1水平降低，且二者间呈负相关；此外，血清JAK2、SOCS1水平均与肠道菌群数量及免疫功能指标存在相关性，即随着血清JAK2水平升高、SOCS1水平降低，乳酸杆菌数量、双歧杆菌数量、CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比逐渐降低，大肠埃希菌数量、肠球菌数量、CD8+T淋巴细胞百分比逐渐升高，这为临床治疗AIS提供了新方向。然而本研究为回顾性、小样本量、单中心研究，可能会对结果造成一定偏倚，未来可扩大样本量、联合多中心进一步验证本研究结论。

作者贡献：付楠良、郝婷婷进行文章的构思与设计、数据收集；付楠良撰写论文；付楠良、刘玺昌进行论文的修订；刘玺昌进行统计学处理，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。