角膜移植术后植片失功患者的病毒学检测

郭雨欣 孙彬佳 彭荣梅 洪晶

1北京大学第三医院眼科 眼部神经损伤的重建保护与康复北京市重点实验室,北京100191;2温州医科大学附属眼视光医院,温州325027

角膜植片失功是导致角膜移植手术失败的直接原因。既往认为,植片失功的主要病因包括角膜移植手术后的免疫排斥反应和植片内皮细胞的自然衰竭。随着角膜移植手术技术及围手术期用药的不断改良和规范,植片失功的发生率已明显下降。然而,近年来有关角膜移植术后病毒感染引起植片失功的报道逐渐增多[1-2],国内尚无相关发病率统计。国外文献报道,取角膜移植术后失功的植片进行检测,3.9%～14.3%呈病毒阳性[3-4],可见病毒感染已成为角膜移植手术失败的重要原因。角膜移植术后病毒感染多为术后数日至数年出现的角膜内皮炎,其发病可能与既往隐匿感染漏诊、局部组织内潜伏病毒激活和角膜植片病毒传播有关[1-2,5]。裂隙灯显微镜下的典型表现为角膜局限或弥漫水肿,并且水肿区的角膜内皮会出现散在或斑块状的污秽色素羊脂状角膜后沉着物(keratic precipitates,KP);部分合并小梁网炎者可出现中度眼压升高[6]。角膜移植术后患者常规应用糖皮质激素及免疫抑制剂导致病毒感染的临床表现往往不典型,临床诊断时常依赖于房水或角膜组织的病毒PCR检测。然而,对于病程较长的病例单纯应用PCR检测能否有效诊断病毒感染尚不明确。本研究拟探讨角膜移植术后植片失功患者行再次角膜移植手术时病毒学检测结果以及多种病毒检测手段的诊断效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用病例对照研究,连续纳入2018年3—12月就诊于北京大学第三医院眼科、临床诊断为角膜移植术后植片失功且具有角膜移植手术指征的患者14例作为植片失功组;另外连续纳入同一中心同时期内临床诊断为大泡性角膜病变(bullous keratopathy,BK)且具有角膜移植手术指征的患者15例作为BK组。所有患者入组前根据自述及既往病历记录明确末次角膜移植或内眼手术的时间、次数及具体术式,经过最佳矫正视力、iCare回弹式眼压计、裂隙灯显微镜、眼前节光学相干断层扫描(anterior segment optical coherence tomography,AS-OCT)、活体激光扫描共聚焦显微镜(invivoconfocal microscopy,IVCM)检查明确临床诊断及手术指征,除外前房及角膜内皮有明显炎症未控制的情况。纳入标准:(1)角膜移植术后植片失功 角膜移植术后出现的角膜植片水肿,可伴或不伴KP,AS-OCT检查显示角膜均匀水肿、中央厚度>650 μm,IVCM检查显示角膜内皮细胞密度<500/mm2或测不出。应用试验性抗病毒、抗排斥治疗后未见好转。(2)BK 内眼手术中明确存在角膜内皮损伤病史或术后3个月以上出现的角膜水肿,AS-OCT检查显示角膜均匀水肿、厚度>600 μm,IVCM检查显示角膜内皮细胞密度<500/mm2或测不出。排除标准:(1)既往有其他非病毒性角膜或眼内感染史;(2)硅油填充眼;(3)患有免疫缺陷性疾病者;(4)BK组中存在既往眼部病毒感染病史者。2个组患者均为单眼发病,组间性别分布及发病时间(患者主诉或出现角膜植片水肿/混浊体征至本次角膜移植手术的时间)比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);植片失功组患者年龄明显低于BK组,本次发病距末次角膜移植时间明显短于BK组,差异均有统计学意义(均P<0.05)(表1)。本研究遵循《赫尔辛基宣言》,研究方案经北京大学第三医院伦理委员会批准(批文号:2017299-02),所有患者均对本研究知情同意并签署知情同意书。

表1 2个组患者基线特征比较Table 1 Comparison of demographics between two groups组别例数/眼数年龄(x±s,岁)a性别构成比(男/女,n)b发病时间(x±s,个月)a本次发病距末次角膜移植时间(x±s,个月)a植片失功组14/1442.7±28.17/715.0±24.616.3±17.7BK组15/1562.9±17.09/612.3±11.662.0±58.1t值 -2.326-0.475-2.908P值 0.0300.7150.6390.010 注:(a:独立样本t检验;b:Fisher精确检验) BK:大泡性角膜病变;-:无数据 Note:(a:Independent samples t-test;b:Fisher exact test) BK:bullous keratopathy;-:no data

1.2 方法

1.2.1标本采集 角膜移植手术当日采集患者静脉血清标本。角膜移植前通过前房穿刺收集至少0.2 ml房水标本,在植床制备过程中获取患者全层角膜或内皮/后弹力层组织。所有标本均置于无RNA/DNA酶的离心管[爱思进生物技术(杭州)有限公司],-80 ℃保存。

1.2.2手术方法 所有手术均由同一医师完成。(1)角膜内皮移植术应用于中央角膜厚度<1 000 μm且无明显基质混浊的患者。术前30 min术眼点用2%毛果芸香碱3次缩瞳,成年患者采用球后麻醉,儿童采用全身麻醉。植床、植片直径均为8.0 mm。于上方角膜缘外1.0 mm处制作3.0 mm隧道切口及2～3个1.0 mm侧切口,前房内注入黏弹剂后,应用反向晶状体勾剥除标记植床范围内后弹力层,手动注吸吸除前房内黏弹剂。应用人工前房及自动微型角膜刀完成厚度为100～120 μm的植片制作,10-0尼龙线牵引辅助植入植片。通过角膜表面挤压辅助展开、居中内皮植片后,前房注入空气泡支撑、固定植片。(2)穿透角膜移植术应用于中央角膜厚度≥1 000 μm的患者。术前30 min术眼点用2%毛果芸香碱3次缩瞳,静脉输注20%甘露醇250 ml,采用全身麻醉。植床直径为7.5～8.0 mm,应用角膜环钻钻取角膜深度1/2～3/4,行前房穿刺,前房内注入少量黏弹剂,用角膜剪完成植床制作,冲洗眼内黏弹剂。植片直径较植床大0.5 mm,采用10-0尼龙线间断缝合16针。

1.2.3病毒检测 检测病毒种类包括单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)、带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)和巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)。(1)实时PCR检测房水、角膜标本中病毒DNA 应用试剂盒QIAamp DNA Microkit (50)(德国Qiagen公司)提取房水及角膜组织核酸。采用Prism 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行PCR检测。HSV-1/2、VZV和CMV的引物及探针由标准核酸测定试剂盒(上海之江生物科技股份有限公司)提供。扩增条件:37 ℃预变性2 min,94 ℃变性2 min;93 ℃变性15 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,循环40次;单点荧光检测在60 ℃,反应体系为40 μl。(2)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清及房水中病毒抗体含量 由实验室另一不知晓PCR检测结果的技术员进行抗体检测。应用ELISA试剂盒分别检测房水及血清中HSV-1/2、VZV、CMV的特异性IgG抗体水平(德国维润赛润研发有限公司)以及总IgG抗体水平(美国BD公司),并计算Goldmann-Witmer系数(Goldmann-Witmer coefficient,GWC)。GWC=(房水特异性IgG抗体滴度/房水总IgG抗体滴度)/(血清特异性IgG抗体滴度/血清总IgG抗体滴度)。若房水标本中某一病毒特异性抗体滴度>9 U/ml且其GWC>3,则认为眼内有特异性病毒抗体生成。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 病毒检测

植片失功组4眼因前房浅在角膜移植术中未获得足量房水,仅行房水及角膜组织PCR检测;其余10眼及BK组15眼均进行病毒DNA及抗体检测。

植片失功组共9眼(9/14)发现至少一项病毒检测结果阳性,其中CMV阳性6眼(6/14),VZV阳性3眼(3/14)。植片失功组中,房水PCR阳性5眼(5/14),角膜组织PCR阳性5眼(5/14),房水病毒抗体GWC升高3眼(3/10);其中,存在2种检测结果阳性者2例(2/10),3种检测结果均阳性者仅1例(1/10),各检测方法间一致性差(表2)。BK组2眼(2/15)房水CMV GWC升高,其GWC分别为3.02和4.91,其余均为阴性。植片失功组病毒检测阳性率为64.2%(9/14),明显高于BK组的13.3%(2/15),差异有统计学意义(P=0.014)。

表2 植片失功组的临床特征及病毒检测Table 2 Clinical characteristics and virological analysis results in graft failure group编号性别年龄(岁)眼别发病时间(个月)本次发病距末次角膜移植时间(个月)眼部临床特征病毒检测阳性术后高眼压多次角膜移植手术史a既往病毒性角膜炎b房水PCR角膜组织PCRGWC[病毒(数值)]1男52右123------2男76右30--+CMV--3男65左654------4女50左62+-+--CMV(3.18)5男5左1224++-CMVCMVCMV(9.72)6女6左1248+--VZVVZV-7女59左3612+++-CMVCMV(37.49)8男62左630--+--N/A9女79右618-----N/A10女1左126----CMVN/A11女4右126++--CMVN/A12女29左21+-+---13男51左13---VZV--14男59右951+-+VZV-- 注:a:指本次角膜植片失功前即存在≥2次角膜移植手术史;b:指在首次角膜移植手术前即存在病毒性角膜炎病史;PCR:聚合酶链式反应;GWC:Goldmann-Witmer系数;CMV:巨细胞病毒;VZV:带状疱疹病毒;N/A:不适用 Note:a:at least twice keratoplasty experience before this graft failure;b:diagnosed with viral keratitis before the initial keratoplasty;PCR:polymerase chain re-action;GWC:Goldmann-Witmer coefficient;CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;N/A:not applicable

2.2 植片失功组病毒检测阳性与临床特征的一致性分析

植片失功组中7眼(7/14)出现角膜植片失功前有高眼压表现,3眼(3/14)在本次角膜移植术前即存在≥2次的角膜移植手术史,6眼(6/14)在首次角膜移植术前即存在病毒性角膜炎病史,与术中病毒检测结果一致性均差(kappa=0.143、-0.155、-0.286)。

3 讨论

对于植片失功患者,再次行角膜移植时明确病因至关重要。既往有角膜移植手术史者,对于排斥反应或内皮细胞自然衰竭继发的植片失功,再次行角膜移植后均建议适当增加糖皮质激素及免疫抑制剂应用强度和时间[7]。而对于病毒感染继发的植片失功,大量糖皮质激素及免疫抑制剂反而增加潜伏病毒再激活风险。通过联合多种检测手段,本研究在植片失功患者中发现9眼(9/14)存在至少一项病毒检测结果阳性,其中CMV为主要致病原。本研究中病毒阳性率明显高于既往研究[3-4],分析可能原因为:(1)检测病毒种类和手段不同。本研究联合多种检测手段筛查HSV、VZV及CMV感染情况,而文献[3-4]仅通过PCR或免疫组织化学方法检测HSV-1;(2)本研究中主要致病原为CMV,其所致角膜内皮炎在亚洲人群中发病率明显高于其他人群。例如,有英国研究者回顾筛查失功角膜植片均未发现CMV感染[8],而中国台湾研究者在角膜移植术中行病毒检测发现CMV感染率高达36.7%[5]。鉴于CMV感染致植片失功病例报道也多集中在东南亚地区[9-10],不排除发病存在种族差异可能。

角膜移植术中进行病毒检测的另一目的是明确患者眼内是否仍存在活动性感染。既往研究中发现,角膜移植时植片或受体若病毒检测阳性,其术后角膜细胞丢失率明显升高,且术后植片失功比例更高[1-2,11]。Fernndez López等[9]报道CMV房水阳性病例在角膜内皮移植后其植片存活时间仅为(8.0±3.8)个月,而这主要与病毒感染在角膜移植术后复发有关。Ang等[10]报道,对于既往有CMV性角膜内皮炎病史的患者,即使在经过成功抗病毒治疗、房水PCR检测转阴的情况下,角膜内皮移植术后1年内也仍有60%的复发率。尽管目前房水的PCR检测是诊断多种眼内病毒感染性疾病的金标准,但我们认为对于慢性病程患者,其实际诊断效能有限。本研究植片失功组中,过半患者(9/14)至少一项病毒检测结果阳性,其中仅5例(5/14)房水PCR阳性,多种病毒检测结果一致性较差,这可能为病毒感染在角膜移植术后发病率高提供了一种解释。一方面,有3例房水PCR检测阴性而角膜组织标本检测阳性。由于角膜移植术中常规仅涉及中央8～9 mm直径范围内中央全层或板层角膜,植床或前房内的感染灶可能在后期累及植片。另外,2例病例房水PCR检测结果为阴性但抗体GWC升高,这可能与病毒感染病程后期病理过程已由病毒复制转为免疫反应有关。文献报道,病毒性葡萄膜炎发病超过2个月后也存在房水中难以检测出病毒核酸的情况[12]。此外,房水中本身细胞含量低也可能导致PCR出现假阴性结果。与单纯行房水病毒PCR检测相比,角膜移植术中联合多种检测手段发现漏诊的活动性感染更有助于指导术后的抗病毒治疗及随访。

角膜移植术后的病毒感染一直是临床诊疗中的难点。近年来,随着相关病例报道的累积,有研究者试图总结其临床表现特点,为诊断提供帮助[6]。例如典型病例常伴发病毒性前葡萄膜炎,可出现轻中度眼压升高;既往的病毒性角膜炎病史或反复的角膜移植手术史也可能提示植片失功与病毒感染有关。但在本研究的植片失功组内,以上因素与病毒检测结果之间一致性差,这可能与本研究中发病时间较长有关。角膜移植术后眼压升高较常见,且病因复杂,难以作为独立的鉴别点。而既往病毒感染史以及多次角膜植片失功、角膜移植病史,可能会由于早期临床上病毒检测手段相对受限,存在一定的误诊、漏诊,导致其在鉴别诊断时参考价值有限。综上,尽管部分病毒感染所致的植片失功可能存在一些特征性临床表现,在考虑再次行角膜移植时,仍建议联合多种病毒检测手段以明确病因。

此外,本研究结果显示,BK组中2例(2/15)CMV GWC升高,表现为弥漫角膜水肿而不伴明显前房炎症反应。伪装为BK的非典型内皮炎文献中也有报道[13],本研究中2例患者也可能实为内皮炎病例。另一可能则是目前通用的GWC阳性阈值(>3.0)设定偏低,对于角膜内皮炎或葡萄膜炎的诊断特异性不足。

本研究的局限性主要在于样本量较小,部分患者在角膜移植术前已应用抗病毒治疗,因此病毒检测结果与角膜植片失功早期的病毒感染发病情况存在一定差异。另外,由于患者房水量有限,部分病例无法兼顾多种病毒核酸及抗体检查。若疾病早期能够通过检测明确感染的病原体,在后续角膜移植中则能够选择特定病原体的多种检测手段综合诊断。

综上所述,病毒感染为角膜植片失功的常见病因。由于病程较长且临床表现不典型,再次行角膜移植术中联合多种病毒检测手段有助于明确病因及病毒感染状态,指导后续治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明郭雨欣:设计试验、分析/解释数据、论文撰写;孙彬佳:设计试验、实施研究、采集数据;彭荣梅:分析/解释数据、论文修改审查;洪晶:研究指导、论文修改审查