和田羊FGF5基因RNA干扰载体构建及筛选

曹少奇，陈岩，高新梅，喻恒彬，王静*，胡广东*

（ 1.新疆维吾尔自治区畜牧总站，新疆 乌鲁木齐 830000 ； 2.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832061 ）

和田羊是历史悠久的地方半粗毛羊品种，但由于育种工作落后，导致生产性能发生退化。因此，对控制和田羊羊毛的性状相关基因进行深入研究，进一步改善和田羊的羊毛品质，对和田羊种质资源的开发与保护具有重要意义[1]。毛囊是支持哺乳动物毛发形成和生长的重要器官，其周期受血管内皮细胞生长因子[2]、骨形态发生蛋白4[3]、胰岛素样生长因子1[4]、FGF5[5]等多种信号分子的调控，FGF5是控制毛囊从生长期向退行期转换的关键因子[6]。FGF5由3个外显子和两个内含子构成，具有调控毛囊周期的功能，是调节毛发生长的重要因子之一。在对小鼠、驴、犬、猫、人的试验中均发现FGF5基因的表达量与毛发生长有关，也有研究发现FGF5基因的表达与绒山羊的羊绒生长有关[7]。综上，沉默或敲除FGF5因子研究其对动物产毛性状的影响，对提高产毛动物的毛产量具有重要意义。

对绒山羊中使用RNAi技术进行FGF5敲除试验，结果表明，RNAi技术可有效降低FGF5的表达[8-9]，且FGF5敲除后对绒山羊的血液生理生化指标[10]、发情能力[11]无显著影响。本研究中设计并合成了4个shRNA，将其与pGPU6/GFP/Neo质粒连接构建干扰表达载体，将干扰载体转染至和田羊成纤维细胞，检测其对和田羊FGF5基因的mRNA和蛋白表达水平的干扰效率，筛选出干扰效率最强的shRNA，为进一步探讨和田羊中FGF5基因的作用机制、改善和田羊毛质量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用和田羊由石河子大学兽医站饲养，剪取和田羊耳部组织分离培养获得成纤维细胞。

大肠杆菌DH5α购自天根公司；质粒pGPU6/GFP/Neo购自上海吉玛技术有限公司。

胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶购自Gibco；20×PBS、质粒提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；青霉素-链霉素（HyClone）；Trizol（Invitrogen公司）；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒（TaKaRa公司）；抗GADPH鼠单克隆抗体、抗FGF5鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（Abcam公司）。

CO2培养箱（Thermo公司）、超净工作台（日本日立公司）、LightCycler 96实时荧光定量PCR仪（罗氏公司）；垂直电泳仪、凝胶成像系统、半干转膜仪（美国BIO-RAD公司）；水平板电泳仪（上海天能科技有限公司）。

1.2 和田羊FGF5基因靶向寡核苷酸的设计与制备

依据和田羊FGF5基因CDS区与shRNA的设计原则，使用Life Technologies公司网站（http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/brands/ambion.html）中的shRNA target design工具，设计得到4条长度为54 bp的shRNA干扰片段PR-FGF1、PR-FGF2、PR-FGF3、PR-FGF4和1条长度为51 bp的阴性对照片段PR-FGF5，片段序列信息见表1。

表1 FGF5 RNA干扰片段序列信息Tab.1 FGF5 RNA interference fragment sequence information

shRNA干扰片段上下游分别引入BamH Ⅰ酶切位点和Bbs Ⅰ酶切位点，由上海生工生物工程有限公司合成相应的shDNA单链。

1.3 RNA干扰载体的构建

将所得的单链shDNA使用20 μL体系（Sense 1 μL、10×SSC 1 μL、Anti-Sence 1 μL、ddH2O补齐）进行退火连接；反应条件为95 ℃变性10 min，室温冷却1 h；获得双链shDNA。

4条干扰片段分别命名为shRNA-FGF1、shRNAFGF2、shRNA-FGF3、shRNA-FGF4，阴性对照片段命名为shRNA-FGF5。使用限制性内切酶BamH Ⅰ和Bbs Ⅰ对质粒pGPU6/GFP/Neo进行双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行回收，得到线性化的质粒pGPU6/GFP/Neo。将合成的5条双链shDNA，分别与线性化的pGPU6/GFP/Neo质粒4 ℃过夜连接，连接产物转化入感受态细胞中，过夜挑取单菌落至培养管，摇菌扩大培养，进行质粒提取后获得重组质粒。重组质粒利用BamH Ⅰ进行单酶切鉴定后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.4 重组质粒酶切鉴定

重组质粒酶切体系为：10×buffer H 1 μL，BamH Ⅰ酶0.5 μL，BSA（10 g/L）0.25 μL，质粒4 μL，灭菌超纯水补至10 μL。离心混匀后，置37 ℃水浴2 h；65 ℃经10 min灭活内切酶，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5 细胞培养和细胞转染

采取和田羊耳部组织块，使用PBS溶液（含有50万单位青霉素-链霉素）清洗，之后用75%酒精浸泡2 min，再次使用PBS溶液仔细清洗。在超净工作台中将组织块表皮去除，在PBS溶液中将组织块剪碎至糊状，使用PBS溶液离心清洗3～5遍，胰酶消化后再次使用PBS溶液离心清洗3～5遍，将清洗后的组织块种至60 mm培养皿中，在细胞培养箱（37 ℃、5% CO2）中放置5 min，待组织块贴壁后取出，在培养皿中添加含有10% FBS的DMEM/DF12完全培养基（含有20万单位青霉素-链霉素），放入细胞培养箱中培养，2 d后更换培养基，4 d后可见耳部组织块周围迁移出成纤维细胞，2 d更换一次培养基继续培养至细胞数量可用。利用电刺激转染的方式将5种RNA干扰载体转染至成纤维细胞，24 h后观察绿色荧光蛋白GFP6表达情况。

1.6 RT-PCR检测FGF5 mRNA表达水平

电转染24 h后，使用TRIzol试剂盒提取各组细胞的总RNA，反转录为cDNA通过RT-PCR检测细胞样品中FGF5基因表达量，重复3次。定量引物序列为：AAGACTGGGCGGGAGTGGTA；GGCTTGACGGGATTAGGTG。采用2-ΔΔCt法计算FGF5基因的相对表达量。

1.7 WB检测FGF5蛋白表达水平

电转染36 h后，弃掉培养液，使用RIPA裂解液裂解各组细胞提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度并计算出SDS-PAGE电泳上样量，电泳至溴酚蓝刚跑出，半干转法转膜，之后用5%脱脂奶粉室温摇床孵育，封闭1 h。剪取一次性塑料手套指头部分，将膜放入其中，将稀释好的一抗滴到膜上，使用封口机封口，4 ℃过夜孵育。TBST洗膜2次，向50 mL离心管中加入稀释过的二抗，将膜放入其中，室温摇床孵育1 h，TBST洗膜2次。使用HRP-ECL发光法进行鉴定，确定FGF5蛋白表达量。

1.8 数据统计与分析

使用SPSS 19.0统计学软件对转染后的成纤维细胞中FGF5基因表达量进行单因素方差分析。P＜0.05表示显著差异，P＜0.01表示极显著差异。

2 结果与分析

2.1 和田羊FGF5基因shRNA干扰载体的构建与鉴定结果

将合成的5条寡聚核苷酸片段与pGPU6/GFP/Neo载体连接，转化、挑菌、摇菌、质粒提取，获得重组质粒。重组质粒利用BamH Ⅰ进行单酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，重组质粒pGPU6-shRNA BamH Ⅰ单酶切鉴定结果见图1。

图1 重组质粒pGPU6-shRNA BamH I单酶切鉴定Fig.1 Gel electrophoresis of recombinant interference vector with single enzyme digestion

由图1可知，BamH Ⅰ单酶切后5个重组质粒均只出现1条条带，且大小符合预期。将提取的质粒送公司测序，测序结果与设计序列相符，表明4个干扰表达载体均构建成功，pGPU6-shRNA载体图谱见图2。

图2 pGPU6-shRNA载体图谱Fig.2 PGPU6-shRNA vector map

将5个pGPU6-shRNA的载体分别命名为pGPU6-shRNA-FGF1（即PR-FGF1）、pGPU6-shRNA-FGF2（即PR-FGF2）、pGPU6-shRNA-FGF3（即PR-FGF3）、pGPU6-shRNA-FGF4（即PR-FGF4）、pGPU6-shRNAFGF5（即PR-FGF5）。

2.2 绵羊耳部成纤维原代细胞及质粒转染细胞（见图3）

图3 绵羊耳部成纤维原代细胞及质粒转染细胞Fig.3 Sheep ear fibroblasts primary cells and plasmid transfected cells

由图3（a）可知，培养2 d后组织块周围迁移出绵羊耳部成纤维细胞；由图3（b）可知，组织块培养培养4 d后成纤维细胞的细胞密度约为80%。

利用电激转染的方式将5种RNA干扰载体转染至成纤维细胞，24 h后通过荧光显微镜观察荧光情况。

由图3（c）、3（d）可知，转染后细胞可见绿色荧光，表明成纤维细胞中开始表达外源绿色荧光蛋白，干扰载体转染成功。

2.3 干扰载体对FGF5基因沉默效率检测结果

以转染阴性质粒PR-FGF5的成纤维细胞为对照，采用qRT-PCR检测成纤维细胞转染4个干扰载体和阴性质粒后FGF5基因mRNA表达量，结果见图4。

图4 重组质粒转染后FGF5 mRNA表达量Fig.4 Expression of FGF5 mRNA after transfection with recombinant plasmid

由图4可知，4个shRNA干扰表达载体均能够不同程度干扰成纤维细胞中FGF5 mRNA的表达。PR-FGF1组、PR-FGF2组、PR-FGF3组、PR-FGF4组干扰效率分别为23.91%、58.85%、85.20%、43.59%，均显著低于PR-FGF5组（P＜0.05），其中重组质粒PR-FGF3对FGF5基因的干扰效率最高。

以转染阴性质粒PR-FGF5的成纤维细胞为对照，以GAPDH为内参蛋白，采用WB检测成纤维细胞转染4个干扰载体和阴性质粒后FGF5蛋白表达量，结果见图5。

图5 重组质粒转染后FGF5蛋白表达量Fig.5 Expression level of FGF5 protein after transfection with recombinant plasmid

由图5可知，与PR-FGF5组相比，PR-FGF1组、PRFGF2组、PR-FGF3组、PR-FGF4组中FGF5蛋白表达量均明显降低。其中，PR-FGF3组中FGF5蛋白表达量降低最显著，WB结果与qRT-PCR结果趋势相同。

结果表明，PR-FGF3 RNA干扰片段抑制FGF5基因表达效果最佳。

3 讨论

成纤维细胞生长因子（FGFs）属于多肽类生长因子，通过与酪氨酸激酶型FGF受体（FGFRs）结合发挥作用[12]。目前在单细胞动物中并未发现FGFs基因，已发现的FGFs与FGFR基因全部存在于多细胞动物中。线虫中存在两种FGFs，人和小鼠中存在23种FGFs，因此，FGFs基因种类可能随着生物的进化不断增多，并构成越来越复杂的调控网络，参与更多的生物学功能。据此，深入研究FGFs及其受体FGFRs基因的调控网络将为研究动物生长、生理调控过程和演化中生物功能的变化奠定基础。

FGF5是FGFs家族的一员，广泛存在于多种哺乳动物中。但有研究发现，不同动物中FGF5蛋白存在明显的区别，目前，FGF5在人和小鼠体内的主要作用是调控毛囊生长，是已知最有效的诱导毛囊从生长期转换到休止期的因子。FGF5在毛囊生长期末期高表达，可促进毛囊从生长期至退行期的转换，从而抑制毛发生长[13]。采用RNAi技术或FGF5抑制剂对FGF5基因进行抑制后，FGF5蛋白表达量降低，毛囊生长期被延长。

与野生型小鼠相比，通过基因打靶技术敲除FGF5基因的小鼠毛发生长速度明显升高[14]，FGF5基因敲除的绵羊羊毛长度和产量均有所提高[15]。研究表明，FGF5抑制因子对人类脱发具有治疗效果[16]，也可以促进小鼠毛发生长[17]。FGF5能够改变真皮乳头细胞的活性，抑制真皮乳头细胞介导的外跟梢细胞的增殖，进而调控毛囊周期，抑制毛发生长，诱导毛发再生[18]。研究发现，将绵羊的FGF5敲除后，FGFR1、雄激素、Wnt/β-catenin、Shh/Gli2、c-MYC等因子产生了变化并存在一些相互作用[19]。有研究表明，FGF5可影响绵羊毛囊发育与毛发生长[20]。综上所述，在生物、细胞、分子水平上继续深入研究FGF5对毛发发育的影响具有重要的意义和较高的可行性。

本研究通过RNAi技术构建并筛选出了干扰效率达到85.2%的和田羊成纤维细胞FGF5基因干扰载体，可作为后续和田羊FGF5的RNAi序列，为研究FGF5对和田羊羊毛生长的调控、改善和田羊羊毛质量提供技术支持。在此基础上，可进一步在其他毛囊相关细胞中进行FGF5敲除试验，以探究FGF5在毛囊周期调控网络中的作用；同时可将FGF5基因干扰与FGF5抑制剂进行对比，探究FGF5抑制剂应用于和田羊毛生产的可能性。

4 结论

本研究构建并筛选出了和田羊FGF5基因的干扰表达载体，经细胞验证可高效干扰和田羊FGF5基因的表达，可应用于和田羊FGF5基因功能的研究中。