基于网络药理学探讨银黄可溶性粉治疗鸡沙门氏菌病的作用机制

王婷婷，韦秋旭，张铭林，谢小东，朱浩，赵微微，秦俊杰，胡庭俊*

（ 1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005 ；2.北京生泰尔科技股份有限公司，北京 102600 ； 3.北京市中兽药工程技术研究中心，北京 102600 ）

鸡沙门氏菌病是由沙门氏菌引起的一种人畜共患病，会导致雏鸡腹泻和全身败血症，甚至引起人腹泻、呕吐、发热[1]。目前，养殖户主要通过抗生素预防及治疗鸡沙门氏菌感染，但是抗生素长期使用会使细菌产生耐药性，导致治疗效率降低[2]。诸多研究表明，中草药及其制剂能够通过多成分、多途径、多靶点发挥抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎的功效，且具有不易产生耐药性的特点，因而在鸡场中的使用频率逐渐提高。中兽医辨证认为，鸡沙门氏菌感染后的症状以脾虚湿盛为主，脾虚则水湿不运，水湿容易下趋大肠，导致腹泻，治疗时应清热解毒，化湿调气，改善肠道温湿环境。由金银花-黄芩配伍研发而成的银黄可溶性粉具有清热解毒、宣肺燥湿功效，可有效改善鸡沙门氏菌感染。饲料中添加金银花对提高鸡的生长性能、抗氧化性、免疫指数等具有很好的促进作用[3]。黄芩富含有黄酮、甾体和生物碱，具有较好的抗炎、抗菌、抗肿瘤的效果[4]。银黄可溶性粉目前主要用于治疗鸡大肠杆菌感染，在临床中初步尝试发现，银黄可溶性粉对治疗鸡沙门氏菌感染也具有一定效果，但作用机制并不清楚。本文通过网络药理学初步探究银黄可溶性粉治疗鸡沙门氏菌的作用机制，旨在为进一步建立分子对接网络预测模型奠定基础，为银黄可溶性粉应用于鸡病的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 银黄可溶性粉-有效成分-靶点的网络图构建

利用TCMSP（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索银黄可溶性粉中金银花和黄芩的有效成分及靶点，从Uniport数据库（https://www.uniprot.org/）下载鸡的基因组。利用“VLOOKUP”函数筛选靶基因，将获得的药物成分和靶点导入Cytoscape3.9，绘制银黄可溶性粉-成分-靶点网络图。

1.2 鸡沙门氏菌疾病靶点的获取

以“Salmonella gallinarum”为关键词，通过GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM（https://omim.org/）数据库搜索鸡沙门氏菌的疾病靶点。

1.3 PPI蛋白互作网络构建

通过venny2.1.0在线网站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将获得的银黄可溶性粉和鸡沙门氏菌的靶点复制粘贴，制作韦恩图，交集基因为药物疾病共同靶点。将其导入String数据库（https://cn.string-db.org/），得到银黄可溶性粉和鸡沙门氏菌蛋白互作图并导出TSV文件，将靶点信息导入Cytoscape3.9进行分析和可视化，利用Excel软件筛选出degree排名前15的核心靶点。

1.4 Go和KEGG富集分析

将治疗靶点粘贴至DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）的分析框，选择“OFFICIAL-GENESYMBOL”，物种选择“Gallus gallus”，点击“gene list”，上传数据后，下载GO和KEGG数据。设置P＜0.01，筛选GO和KEGG条目，利用微生信在线平台进行数据可视化分析。

2 结果与分析

2.1 银黄可溶性粉活性成分筛选和有效成分-靶点的网络图构建

利用TCMSP数据库筛选出黄芩含有36种有效成分，507个靶蛋白；金银花含有23种成分，449个蛋白。Uniport数据库下载已验证过的鸡基因2 211个，利用“VLOOKUP”函数将TCMSP数据库筛选得到的成分和靶蛋白与已验证过的鸡基因进行标准化后得到42种活性成分和61个靶点。将成分和靶点导入Cytoscape3.9构建银黄可溶性粉有效成分-靶点网络图，见图1。

图1 银黄可溶性粉-有效成分-靶点网络图Fig.1 Plot of Yinhuang soluble powder - active ingredient - target network

由图1可知，该网络包含105个节点和10 920条边。根据degree值筛选出前十的药物有效成分和靶点，结果见表1和表2。

表1 银黄可溶性粉-成分-靶点网络图中节点连接度前十的有效成分Tab.1 Top 10 active components in node connectivity of Yinhuang soluble powder-composition-target network diagram

表2 银黄可溶性粉-成分-靶点网络图中节点连接度前十的靶点Tab.2 Top 10 targets with node connectivity in Yinhuang soluble powdercomposition target network diagram

2.2 银黄可溶性粉与鸡沙门氏菌病的交集靶点（见图2）

图2 银黄可溶性粉与鸡沙门氏菌病的交集靶点Fig.2 Intersection target of Yinhuang soluble powder and Salmonella gallinae

由图2可知，通过GeneCards和OMIM数据库共搜索到鸡沙门氏菌病的靶点1 409个。将这些疾病靶点与61个药物靶点导入venny2.1.0，得到30个共同靶点，为银黄可溶性粉治疗鸡沙门氏菌的作用靶点。

2.3 药物与疾病靶点蛋白相互作用结果

将药物和疾病共同靶点导入STRING数据库，物种选择“Gallus gallus”，最低要求的互动分数设置为0.04，构建PPI网络图，结果见图3。将TCSV中的靶点导入Cytoscape 3.9，构建网络图对关键靶点可视化，结果见图4。

图3 银黄可溶性粉-鸡沙门氏菌的PPI网络图Fig.3 PPI network diagram of Yinhuang soluble powder - Salmonella gallinae

图4 银黄可溶性粉-鸡沙门氏菌关键点的PPI网络图Fig.4 PPI network diagram of key points of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae

由图3、图4可知，白细胞介素-6（IL-6）靶点出现的频率最高，其次是B细胞淋巴瘤（BCL2L1）靶点，推测其在银黄可溶性粉治疗鸡沙门氏菌病中发挥较重要的作用。

关键靶点中degree排名前15的核心靶点见图5。

图5 关键靶点中degree排名前15的核心靶点Fig.5 Core targets with a degree of top 15 among key targets

由图5可知，排名前15核心靶点依次是IL-6、BCL2L1、雌激素受体1（ESR1）、缺氧诱导因子（HIF1A）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、NFKB抑制剂α（NFKBIA）、MYC原癌基因（MYC）、白细胞介素-10（IL10）、前列腺素内过氧化物合成酶2（PTGS2）、重组人血红素氧合酶-1（HMOX1）、干扰素γ（IFN-γ）、重组蛋白（IFNG）、一氧化氮合酶（NOS2）、基质金属蛋白酶2（MMP2）、聚[ADP-核糖]聚合酶1（PARP1）。

2.4 GO功能和KEGG富集分析

通过DAVID数据库对关键靶点进行生物过程（biological process）、细胞组成（cellular component）、分子功能（molecular function）等3个方面的GO富集分析，结果见图6～图8。

图6 银黄可溶性粉-鸡沙门氏菌的GO富集分析（生物过程）Fig.6 GO enrichment analysis of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae （biological process）

图7 银黄可溶性粉-鸡沙门氏菌的GO富集分析（细胞组成）Fig.7 GO enrichment analysis of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae（ cellular component）

图8 银黄可溶性粉-鸡沙门氏菌的GO富集分析（分子功能）Fig.8 GO enrichment analysis of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae （molecular function）

由图6～图8可知，设置P＜0.01，共得到44个GO通路，其中生物过程、细胞组成、分子功能分别涉及27、7、10个条目。生物过程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正负调节、丝氨酸磷酸化调节及细胞对缺氧的反应、免疫反应、细胞凋亡等方面的研究；细胞成分主要包括细胞核、细胞质、细胞间隙等；分子功能主要涉及蛋白质二聚体活性、RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区域序列特异性DNA结合和DNA结合、蛋白质结合、蛋白激酶结合。

KEGG富集分析总共得到16条通路，见图9。

图9 银黄可溶性粉-鸡沙门氏菌的KEGG富集分析Fig.9 KEGG enrichment analysis of Yinhuang soluble powder- Salmonella gallinae

由图9可知，KEGG通路主要涉及C-型凝集素受体、细胞凋亡、细胞自噬、细胞衰老、沙门氏菌感染、NOD受体反应、VEGF信号通路、肠道免疫网络的IgA产生、MAPK信号通路等。综上所述，银黄可溶性粉的有效成分可通过细胞核、细胞质、类固醇激素、巨噬细胞活化等多个生物过程参与沙门氏菌感染、肠道免疫网络的IgA产生、VEGF信号通路、MAPK信号通路等多条信号通路，以达到治疗鸡沙门氏菌的目的。

3 讨论

本研究结果显示，TCMSP数据库筛选出银黄可溶性粉含有42个活性成分，61个靶点与鸡沙门氏菌相关。槲皮素、木犀草素、山柰酚均属于黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化的功效，能够促进动物的生长发育。黄酮类化合物能够抑制沙门氏菌的活性，降低血清中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等炎症因子的表达，提高肠组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的表达水平[5]。槲皮素具有抗炎止痛、抗病毒、抗菌、抗溃疡等生物活性，能够调节肠道免疫，维持肠道菌群平衡，促进肠道吸收[6]。山柰酚是Ca+通道阻断剂，能够抑制高K+诱导的持续回肠收缩，治疗回肠痉挛[7]。木犀草素通过核因子κB（NF-κB）信号通路显著下调LPS致炎IEC-6细胞的IL-6、TNF-α、NF-κB等炎症因子的表达，抑制组胺的释放，保护肠黏膜免受损伤[8-9]。黄芩素是黄芩中含量最多的一种活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤的功效，能够显著下调LPS诱导的RAW264.7细胞的一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-6水平[10]。鸡沙门氏菌感染会引起一系列炎症反应，银黄可溶性粉具有良好的抗炎活性，能够缓解机体炎症。由此推断，银黄可溶性粉可通过抗炎和抗菌活性治疗鸡沙门氏菌引起的肠炎性腹泻。

本研究中，PPI网络图表明，IL-6、BCL2L1、ESR1、HIF1A、VEGFA、NFKBIA、MYC、IL-10为治疗鸡沙门氏菌病的关键基因。IL-6是机体急性损伤时重要的炎症因子，是治疗鸡沙门氏菌感染最核心的靶点，主要通过增强CTL细胞和NK细胞的功能，促进特异性抗体分泌[11]。BCL2L1是一种抗凋亡基因，编码的蛋白质与线粒体内环境稳定相关，在正常B细胞的增殖和分化过程中发挥重要作用[12]。ESR1可降低NF-κB的DNA活性，抑制IL-6启动子的转录[13]。HIF1A调节细胞增殖和代谢[14]。VEGFA与血管内皮上的酪氨酸蛋白激酶受体结合，促进细胞存活、新血管形成和血管舒张[15]。NFKBIA是NF-κB抑制剂，通过掩盖NF-κB蛋白的核定位信号（NLS）并将其隔离在细胞质中的非活性状态抑制NF-κB[16]。此外，NFKBIA也是IL-1β分泌的负调节因子，能够减少中性粒细胞的活化，对抗炎和免疫调节起到积极影响。MYC原癌基因蛋白影响细胞生长、增殖、凋亡、代谢等生物学过程，与炎症损伤和修复密切相关[17]。IL-10能够促进组织上皮细胞的先天免疫，抑制炎症引起的组织损伤，保持其上皮层的完整性[18]。综上所述，IL-6、BCL2L1、ESR1、HIF1A、VEGFA、NFKBIA、MYC、IL-10等靶点与炎症有关，表明银黄可溶性粉可能会通过作用于炎症相关靶点发挥治疗沙门氏菌的作用。

GO和KEGG富集分析结果显示，银黄可溶性粉治疗鸡沙门氏菌参与了免疫应答、转录、凋亡等生物学过程及VEGF、MAPK等多个信号通路。鸡群密度过大，空气流动不畅，饲料发霉，饮用水污染等因素引起沙门氏菌感染，损伤鸡呼吸道和消化道。目前临床中多采用庆大霉素、氟苯尼考等抗生素治疗沙门氏菌感染，但是大多数鸡对广谱抗生素具有很大的耐药性，治疗效果不显著[19]。黄芩和桑白皮配伍显著降低了20%酵母悬液致炎的大鼠血清中PGE2、IL-6和TNF-α炎症因子水平[20]。缺氧刺激会启动VEGF的转录，增加其表达量。黄芩苷、黄芩素通过IL-6、TNF-α和VEGF通路抑制胰腺炎癌血管的形成[21]。MAPK信号通路主要调节基因转录、蛋白质合成、细胞增殖、迁移、分化、衰老和凋亡，并介导免疫细胞P38的活化，抑制炎性细胞因子产生[22]。因此，VEGF信号通路、MAPK信号通路是银黄可溶性粉治疗鸡沙门氏菌的主要通路。

4 结论

本研究结果显示，银黄可溶性粉通过槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩素等活性成分，作用于IL-6、BCL2L1、ESR1、HIF1A、VEGFA、NFKBIA、MYC、IL-10等关键靶点，通过VEGF信号通路、MAPK等信号通路，参与免疫应答、转录、细胞凋亡等生物过程，抑制沙门氏菌引起鸡的炎症反应，修复肠道黏膜屏障、降低肠道应激，达到治疗鸡沙门氏菌的效果。