基于差异表达基因研究探讨冠心病心绞痛模型大鼠穴位痛敏化的发生机制

刘雪莹 付红娟 任彦蓉 齐文川 梁繁荣

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease, CHD)是由于冠状动脉粥样硬化导致心肌缺血、缺氧而引起以心绞痛、心律失常等为主要临床表现的疾病[1]。国内外众多研究证实针刺对缺血心肌具有保护作用[2-4]。临床治疗CHD心绞痛多选用心经、心包经穴位,其中内关穴使用频率最高。研究团队在前期临床试验中的研究表明CHD心绞痛患者会出现穴位敏化现象。穴位敏化是指机体在疾病状态下,阴平阳秘被打破,气血阴阳发生变化,腧穴由“沉寂态”变为“激活态”的过程,这跟机体的生理病理状态变化有关,能够实时和动态的反映脏腑的功能状态[5]。但目前关于穴位敏化的产生机制研究尚显不够。近年来差异表达基因研究被越来越多的应用于疾病机制的研究中,这也为穴位敏化发生的生物学机制研究提供了新的思路和平台[6-9]。本研究以穴位敏化理论为基础,通过转录组测序,筛选出CHD心绞痛模型大鼠敏化穴位组织中差异性表达的mRNA,并进行生物信息学分析,明确其生物学功能,从基因调控的角度研究参与穴位敏化发生过程的mRNA及其调控机制,为进一步研究穴位敏化现象提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康SPF级雄性SD大鼠20只,6～8周龄,体质量(200±10)g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[生产许可证号:SCXK(湘)2019-0004],饲养于成都中医药大学针灸推拿学实验研究中心节律室,饲养条件为12小时明暗交替,室温16～28℃,湿度40%～70%。实验前适应性饲养1周,常规喂食标准饲料和自由饮水。按照随机数字表法将实验动物分为空白组(Cc组)、模型组(Tc组),每组10只。实验方案获得了成都中医药大学医学和实验动物伦理委员会的批准。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器:PowerLab多导生理记录仪(澳大利亚AD Instruments公司),电子测痛仪Electric VonFrey(美国 IITC Life Science Inc公司),转轮式切片机(徐卡RM2016,德国LEICA公司),高速低温组织研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司),干浴器干式恒温金属浴(上海达洛科学仪器有限公司),Bio-rad-CFX96、LineGene9600均购于杭州博日科技有限公司,QuantStudio 5 Real-Time PCR System(美国应用生物系统公司)。

主要试剂:Isofluranee(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),10%中性甲醛固定液(福晨化学试剂有限公司),二甲苯(成都市科隆化学有限公司),苏木素染液、伊红染液均购于珠海贝索生物技术有限公司,中性树胶(Biosharp生物公司),Animal Total RNA Isolation Kit、2×RT OR-EasyTM Mix、2×Real PCR EasyTM Mix-SYBR均购于成都福际生物技术有限公司。

1.3 模型制备

参考相关文献[10],采用腹腔注射盐酸异丙肾上腺素(isoprenaline hydrochloride,ISO)构建大鼠心绞痛模型;空白组腹腔注射生理盐水构建对照模型。注射剂量均为2 mg/kg,每24小时注射1次,连续注射14天。

在造模前一天和造模后一天使用PowerLab7多导电生理记录仪进行心脏电生理参数检测和斜方肌肌电信号检测,将大鼠用异氟烷呼吸麻醉后,仰卧于操作台上,将电极浅刺入大鼠肢体皮下,右前肢近心端接电极负极,右后肢近心端接地线,左后肢近心端接电极正极,记录大鼠的心率及心电图变化情况;剔除大鼠颈部及左侧背部毛发,暴露左侧背斜方肌,同芯电极以约30°角斜插入左侧背斜方肌,插入深度约为1.5～1.7 mm,记录左侧背斜方肌的肌电信号[11]。并于造模结束后麻醉大鼠,取心脏组织放入10%中性甲醛固定液中。采用苏木素—伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)法,对心脏组织进行脱水、包埋、切片、染色、封片后,分别于100倍和400倍下采集图片,观察两组大鼠的心肌组织病理形态变化。

造模成功标准:(1)模型组大鼠心电图ST段明显抬高[10,12],见图1。(2)模型组大鼠左侧背斜方肌肌电信号明显增强,表明注射ISO会引发大鼠心脏产生疼痛反应,见图2。(3)模型组大鼠心肌组织可见不等量的心肌纤维坏死,坏死区不同程度纤维组织增生,以成纤维细胞和纤维细胞增生为主,坏死区域内或间质内可见炎性细胞浸润,包括少量单个圆形深染核的淋巴细胞、杆状核的中性粒细胞和细胞较小,核圆偏于细胞一侧的浆细胞,见少量红细胞溢出,坏死区可见新生毛细血管形成。见图3。

图1 造模后大鼠心电图(Ⅱ导联)

图2 造模后大鼠背斜方肌肌电图

注:A:空白组;B:模型组。蓝色箭头示淋巴细胞,橙色箭头示成纤维细胞,黄色箭头示纤维细胞,红色箭头示新生毛细血管。

1.4 实验指标检测与方法

1.4.1 穴位敏化检测 (1)穴位选择与定位:选取大鼠双侧手厥阴心包经上内关穴为特异性经穴,另选择尺泽穴为他经穴位,大鼠臀大肌隆起处为非经非穴。根据由中国针灸学会实验针灸委员会制定的实验动物穴位图谱,取穴定位如下:内关穴:前肢内侧,离腕关节约3 mm左右的尺桡骨缝间。尺泽穴:肘弯横纹偏外凹陷中。非经非穴:大鼠臀大肌隆起处,距环跳穴(后肢髋关节后上缘)外侧5 mm[10]。

(2)穴位机械痛阈检测:采用Electric VonFrey 测痛仪检测造模前和造模后空白组和心绞痛模型组大鼠双侧内关穴、尺泽穴、非经非穴的机械痛阈值。于检测前一天剃除大鼠待检测穴位皮肤毛发。检测当天校正仪器,将大鼠固定在自制鼠台上,将探针头对准检测穴位,垂直、缓慢下压,用力均匀,待大鼠出现嘶叫、甩尾、伸足、缩足等躲避反应时移开探针,读取此时显示屏上数值。每个穴位检测3次,每次检测间隔3分钟以上,取3次数值的平均值,若3次检测数值相差5以上,则重新检测。

(3)穴位敏化判定:参考相关文献[12],以造模前后穴位痛阈值变化率为标准,判断穴位是否发生敏化。痛阈值变化率=(造模后痛阈值-造模前痛阈值)/造模前痛阈值。比较空白组和模型组痛阈值变化率,找出敏化穴位。

1.4.2 转录组测序 选取心绞痛模型组敏化穴位及空白组对应穴位皮肤及皮下组织3 mm×3 mm×3 mm,生理盐水冲洗干净,置于冻存管中迅速投入液氮,干冰送至南京派森诺基因科技有限公司检测。使用TRIZOL试剂提取总RNA,采用Agilent 2100 Bioanalyzer进行总RNA的检测,检测后纯化mRNA。

用Oligo(dT)珠富集带有polyA结构的mRNA,采用离子打断方式,将RNA长度打断成大小为300 bp左右的片段。用6碱基随机引物和逆转录酶,以RNA为模板合成cDNA第一链,再以第一链cDNA为模板,合成cDNA第二链。构建文库,并对文库进行质检。在Illumina测序平台用第二代测序技术,进行文库的双末端测序。利用DESeq对基因表达差异进行分析,筛选出表达差异倍数|log2FoldChange|>1、显著性P<0.05的差异表达基因,并对其进行GO和KEGG富集分析。

1.4.3 RT-qPCR验证 参考相关文献[15-23],挑选出9个与炎症、疼痛、肥大细胞有关的差异表达基因进行RT-qPCR验证,这9个基因分别是Nqo2、Adam11、Gpr65、Ghrhr、Angptl4、Krt16、Mmp11、Chrna1、Hmgcs2,内参基因为Gapdh,引物序列见表1。使用动物组织总RNA提取试剂盒(带gDNA清除柱)提取总RNA,用10 μL RNA溶液和10 μL 2×RT OR-EasyTMMix进行逆转录反应,并于42℃金属浴中反应30分钟,72℃金属浴中反应10分钟。将最终得到的溶液稀释10倍后进行RT-qPCR反应,反应体系为:10 μL 2×Real PCR EasyTMMix-SYBR、10 μL样本和上下游引物各0.3 μL。将10 μL基因特异性qPCR反应液和10 μL样品加入96孔板中,置于实时定量PCR仪中运行,程序如下:95℃,20 s;(95℃,20 s;60℃,20 s)40 cycles;添加溶解曲线。

表1 引物序列

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 穴位敏化检测结果

Shapiro-Wilk test检验提示,双侧内关穴、尺泽穴和非经非穴符合正态分布,使用独立样本t检验。

与空白组相比,模型组双侧内关穴痛阈值显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),表明模型组大鼠左、右内关穴均发生了痛敏化现象。双侧尺泽穴、双侧非经非穴痛阈值变化率组间比较差异不具有统计学意义(P>0.05),没有发生痛敏现象。见表2。

表2 造模前后大鼠痛阈值变化率组间比较鼠只=9)

2.2 差异表达基因筛选结果

通过对空白组和模型组mRNA表达进行分析比较,发现敏化穴位(内关穴)局部的差异表达mRNA共45个,其中上调16个,下调29个,见表3、图4。

表3 两组大鼠差异表达mRNA筛选

注:图中两条竖虚线为2倍表达差异阈值,横虚线为P值=0.05阈值;红点表示该组上调基因,蓝点表示该组下调基因,灰点表示非显著差异表达基因;C为空白组,T为模型组。

2.3 差异表达基因GO富集分析和KEGG通路分析

通过GO富集结果、Rich factor值、FDR值和富集到该GO Term的基因数来衡量富集程度。其中,富集因子(Rich factor)为GO Term中富集到的差异基因数与注释的基因数之比。富集程度越高,Rich factor值越高。FDR取值范围0～1,富集越显著时,FDR值越接近于0。挑选出FDR值最小的前20个GO Term条目,即富集最显著的进行展示,结果表明差异表达基因参与的生物过程包括表皮细胞分化、蛋白变性等;细胞组分包括HAUS复合物、超分子聚合物等;分子功能包括烟酰胺核糖苷还原酶活性、羟甲基戊二酰辅酶a裂合酶活性等,见图5～6。

图5 GO富集分析柱状图

图6 GO富集分析气泡图

通过KEGG富集结果、Rich factor值、FDR 值和富集到该通路的基因数量来衡量富集程度。其中,Rich factor为该通路中富集的差异基因数与注释基因数之比。富集程度越高,Rich factor值越高。选取FDR值最小,即富集最显著的前20条KEGG通路进行展示,结果表明差异表达基因参与的信号通路包括PPAR信号通路、雌激素信号通路等,见图7～8。

图7 KEGG富集分析柱状图

图8 KEGG富集分析气泡图

2.4 RT-qPCR验证结果

对9个差异表达的mRNA进行RT-qPCR验证,通过溶解曲线分析得出,除内参外,其余基因均为单一峰,表明PCR扩增特异性较好。RT-qPCR 结果如表4所示,模型组与空白组比较,Adam11表达上调,差异有统计学意义(P<0.05),与转录组测序结果一致;Gpr65、Nqo2表达上调,差异无统计学意义(P>0.05),与转录组测序结果不一致;Angptl4、Chrna1、Hmgcs2、Krt16表达下调,差异无统计学意义(P>0.05),与转录组测序结果不一致;Ghrhr、Mmp11表达下调,与转录组测序结果一致,但差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 RT-qPCR验证结果组间比较鼠只=6)

3 讨论

CHD属于中医“胸痹”“心悸”“真心痛”等范畴,针灸作为中医传统疗法已被证实在治疗CHD心绞痛方面取得了确切的疗效[24]。针灸治疗CHD多选用内关穴,内关穴是手厥阴心包经的络穴,“循经以上,系于心包,络心系”,有着理气宽胸、活血祛瘀的作用[25]。同时内关穴也是八脉交会穴,通于阴维脉,“阴维为病,苦心痛”。在大量的数据挖掘研究中发现,CHD患者会出现穴位敏化现象,主要表现为:(1)穴位热敏现象,穴位温度改变。(2)穴位力敏现象,按压穴位时出现酸、麻、胀、痛等感觉的改变。(3)穴位光敏现象,CHD患者相关穴位红外辐射强度在与健康人之间存在差异。(4)穴位形敏现象,穴位皮肤发生色泽、形态改变。(5)穴位电敏现象,CHD患者相关穴位皮肤电阻显著升高,左右电阻失衡。(6)穴位痛敏现象,CHD患者相关穴位痛阈值降低。在所有发生敏化的穴位当中,内关穴敏化频次最高,且CHD目前所涉及到的所有敏化形式都在内关穴被检测到,是CHD穴位敏化现象运用于临床诊治的代表性穴位[5]。穴位敏化是指机体疾病状态下,腧穴由“沉寂态”转化为“激活态”的过程,能够帮助诊断和治疗疾病,指导针灸临床选穴。本实验采用Electric Vonfrey 测痛仪检测造模前后CHD心绞痛模型大鼠和空白组大鼠穴位机械痛阈值,比较两组大鼠痛阈值变化率,结果显示模型组大鼠双侧内关穴机械痛阈值明显降低,说明内关穴发生痛敏化现象。该结果也与团队临床检测结果一致。但本研究仅采用穴位机械痛阈值变化率来判断穴位是否发生敏化,评判标准较为单一,还应将其它穴位敏化检测指标一并纳入检测,如穴位温度、穴位电阻、感觉神经定位检测等,多角度评估穴位敏化。

差异表达基因研究是近年来的研究热点,被越来越多的应用于疾病机制的研究中。翟雪芹等[8]探索研究了冠状动脉粥样硬化性心脏病秽浊痰阻证患者差异表达基因及相关信号通路,发现秽浊痰阻证与CHD非秽浊痰阻证患者存在显著的差异表达基因,这些差异表达基因显著富集在与CHD相关的多条功能通路中,从分子水平阐明了其秽浊痰阻证的生物学特点。樊小农等[9]利用基因芯片技术对老年痴呆进行相关基因表达谱研究,探讨差异表达基因在老年痴呆病理机制中的作用。差异表达基因的研究也为穴位敏化发生的分子生物学机制研究提供了新的思路和平台,通过对敏化穴位相关差异性表达基因的研究,探索穴位敏化发生的机制。在有关穴位敏化发生机制的研究中,前人有从神经生物学方面进行探究,崔翔[26]研究发现穴位敏化的发生可能与交感神经有关,胡瑞斌等[27]在后续的研究中发现交感神经兴奋会激活背根节中型神经元表达CGRP来介导穴位敏化的发生。但从差异表达基因方面入手探索穴位敏化产生机制的研究还略显不足。本实验在此方向进行探索研究,通过对大鼠敏化穴位(内关穴)皮肤及皮下组织进行转录组学分析,发现差异表达mRNA共45个,并对这些差异表达的mRNA进行生物学分析,发现了差异表达基因参与的生物过程和信号通路,如PPAR信号通路、雌激素信号通路等。参考相关文献[28-30],这些信号通路可能与穴位痛敏化发生机制有关,有待进一步研究。

在得出的差异表达基因中,进一步通过搜索文献找到与炎症、疼痛、肥大细胞有关的差异表达mRNA共9个[15-23],并对这些差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证,在得出的结果中发现了一条表达显著上调且与转录组测序结果一致的基因——Adam11。有研究表明,Adam11在疼痛传递和引起痛阈值变化的炎症调节机制中发挥作用,由此推测Adam11这条差异表达mRNA可能参与穴位痛敏化发生的调控机制,可做进一步研究[15]。在RT-qPCR验证结果中有的差异基因表达趋势与有参转录组测序结果一致,但无统计学意义;有的差异基因表达趋势与有参转录组测序结果不一致。这可能与检测样本量较小,基因多态性等有关,需增加样本含量进一步验证。

综上所述,本研究从动物实验角度验证了疾病状态下穴位敏化现象发生的客观性,用机械痛阈值检测方法证实了CHD心绞痛模型大鼠内关穴出现了痛敏化现象;从分子生物学水平探索了穴位敏化产生的机制,发现一条差异表达基因Adam11可能参与调控穴位痛敏化的发生,但其具体调控机制还有待进一步深入研究。