柴蜕颗粒通过MAPK/Akt/NF-κB信号通路改善气道炎症治疗咳嗽变异性哮喘的药效及机制研究

杨涵 闫永煌 朱佩轩 吴宇杰 车宇娥 乔诗清 颜芳 张文婷 陈聪 苏泽琦 张偲 王停

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma, CVA)是哮喘的一种特殊类型,是慢性咳嗽患者最常见的病因和典型哮喘的萌芽阶段[1],发病与遗传易感性、免疫系统紊乱、环境因素引发的气道炎症反复发作相关[2]。临床研究表明,32.5%的CVA患者以嗜酸性粒细胞(eosinophil, EOS)性气道炎症为主要病理基础,15%的CVA患者为中性粒细胞(neutrophil, NE)性炎症表型[3]。目前西医常规治疗存在疗效不佳、复发率高、药物不良反应等局限性,中医药治疗具备缓解咳嗽症状、降低复发率、副作用小等优势。柴蜕颗粒化裁于小柴胡汤、二陈汤、三子养亲汤、过敏煎等经典名方,具有祛风解表,宣肺止咳、理气化痰之功,临床治疗CVA多获良效,但柴蜕颗粒治疗咳嗽变异性哮喘的作用机制尚不明确。相关研究表明,细胞外信号调节激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase/p38 mitogen activated protein kinase,ERK/p38 MAPK)信号通路是炎症细胞分化、增殖、活化的关键调控因子,ERK/p38 MAPK通路磷酸化引发2型免疫应答亢进与嗜碱性粒细胞(basophil, BA)脱颗粒诱发过敏性气道炎症[4];丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase, AKT)通过酪氨酸激酶级联信号传导,正反馈调节下游核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65, NF-κB)的转录,引起炎症因子趋化及炎症细胞募集,造成局部肺组织免疫炎症浸润[5]。本研究拟从整体动物水平,探讨柴蜕颗粒治疗咳嗽变异性哮喘的药效及可能的作用机制,为CVA的中药新药研发提供研究思路和参考依据。

1 材料与方法

1.1 动物

Hartley豚鼠,普通级,雄性,体质量(350±20)g,10周龄,购自北京富龙腾飞实验动物研究院有限公司,动物合格证号:SCXK(京)2018-0009,由北京中医药大学动物实验中心饲养。环境温度(22±2)℃,湿度40%～70%,自由摄食饮水,光照周期12小时明暗交替。动物实验设计经北京中医药大学实验动物伦理委员会论证,符合动物伦理学要求(伦理审查编号:BUCM-4-2021110109-4143)。

1.2 药物

柴蜕颗粒方剂组成为柴胡(批号:20210624)、黄芩(批号:20210617)、法半夏(批号:20210620)、乌梅(批号:20210623)、蝉蜕(批号:20210615)、防风(批号:20210605)、化橘红(批号:20210104)、紫苏子(批号:20201217)、炒莱菔子(批号:20210422)、浙贝母(批号:20210623)、桔梗(批号:20210121),药材饮片购自北京本草方源集团有限公司。孟鲁司特钠片(杭州默沙东制药有限公司,批号:U008805,规格:10 mg)。

1.3 试剂

卵白蛋白(ovalbumin, OVA)、乙酰基-β-氯化甲基胆碱(美国Sigma公司,货号分别为:A5503、A2251),氢氧化铝[Aluminium hydroxide, Al(OH)3]凝胶(美国Thermofisher公司,货号:77161),辣椒素(阿拉丁公司,货号:V107238),豚鼠免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)酶联免疫检测试剂盒、白细胞介素4(interleukin-4, IL-4)、干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素10(interleukin-10, IL-10)(武汉华美生物工程有限公司,货号分别为:CSB-E12102Gp、CSB-E10126Gu、CSB-E06763Gu、CSB-E06772Gu、CSB-E12915Gp),全蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,BC3710),BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,货号:P0010),PBS缓冲液(武汉赛维尔生物科技有限公司,货号:G4202),5×SDS-PAGE变性蛋白上样缓冲液(北京普利莱基因技术有限公司,货号:B1012),兔抗ERK单克隆抗体、兔抗p-ERK(Thr202/Tyr204)单克隆抗体、兔抗p38 MAPK多克隆抗体、兔抗p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)单克隆抗体、兔抗Akt多克隆抗体、兔抗p-Akt(Ser473)单克隆抗体、兔抗NF-κB p65单克隆抗体、兔抗p-NF-κB p65(Ser536)单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司,货号分别为:4695、4370、9212、4511、9272、4060、8242、3033),内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)二抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(abcam公司,货号分别为:ab8245、ab6721、ab6789),ECL发光液、10%预制胶(AQ翱擎,货号分别为:AQ529、AQ123-01)。

1.4 仪器

R2003KE型旋转蒸发仪(上海Senco科技有限公司),ZKXFB-2型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司),Multiskan GO型全波长酶标仪、EVOSTMFL Auto 2型台式自动化成像仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司],GelView6000Plus智能图像工作系统(广州博鹭腾生物科技有限公司),小动物肺功能检测系统(美国DSI公司),全自动血细胞分析仪(日本NIHON KOHDEN公司),多功能诱咳引喘仪(江苏赛昂斯生物科技有限公司),Amersham Imager 680化学发光成像仪、MM400型高通量组织研磨机(德国Retsch公司)。

1.5 药物制备

柴蜕颗粒由柴胡7 g、黄芩7 g、法半夏7 g、防风7 g、化橘红7 g、苏子7 g、乌梅6 g、蝉蜕5 g组成,总生药量为53 g,先加入药材总质量10倍的去离子水,煮沸后文火煮1.5小时,过滤收集药液,再加入原药材总质量8倍的去离子水,煮沸后文火煮1.5小时。煎煮液200目滤布过滤后,合并2次药液,趁热离心(8000 r/min,10分钟),减压浓缩(60℃)至相对密度为1.25～1.30(60℃)。浓缩液置于真空干燥箱内,70℃干燥成干浸膏,所得干膏粉出膏率为31.7%。干浸膏粉碎,临用前用动物饮用水配置成相应浓度药液。

1.6 动物造模与给药

将32只Hartley雄性豚鼠适应性饲养7天后,按体质量随机分为正常组、模型组、柴蜕颗粒组、孟鲁司特钠组,每组8只。CVA模型采用徐方蔚等[6]所报道的方法,每只豚鼠肌注4% OVA溶液0.5 mL,同时腹腔注射 2% Al(OH)3凝胶0.2 mL致敏,致敏15天后以1%OVA溶液雾化连续攻击13天,正常对照组以无菌生理盐水连续雾化13天。致敏14天后,各组豚鼠每日雾化前0.5小时灌胃给药,持续14天。末次灌胃24小时后,检测各项指标,以模型组豚鼠咳嗽次数、气道阻力、EOS较正常组升高且具有统计学意义,为模型制备成功的标准[7]。柴蜕颗粒临床应用剂量为每日生药量53 g,按照成人60 kg,人和豚鼠体表面积比1∶6计算得豚鼠等效剂量[8]为5.3 g/(kg·d),孟鲁司特钠组按照0.001 g/(kg·d)给药,豚鼠灌胃量按10 mL/kg标准进行,其余各组每天给以等体积动物饮用水灌胃。

1.7 豚鼠咳嗽敏感性检测

致敏豚鼠末次雾化攻击48小时后,将豚鼠置于诱咳引喘仪雾化吸入10-4mol/L辣椒素溶液5分钟,记录自雾化开始各豚鼠的咳嗽次数及咳嗽潜伏期。

1.8 豚鼠气道阻力检测

致敏豚鼠咳嗽敏感性检测后,用1%戊巴比妥钠4 mL/kg腹腔注射麻醉,行气管插管后,置于密闭的全身体积描记箱中。采用清醒动物肺功能检测系统(PFT系统),观察并记录豚鼠吸入浓度依次为0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的乙酰基-β-氯化甲基胆碱后3分钟内气道阻力的变化。

1.9 豚鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中炎症细胞水平的测定

致敏豚鼠气道阻力检测结束后,腹主动脉取血处死。剪开胸腔,结扎左肺,行气管插管,用PBS缓冲液进行支气管肺泡灌洗。血生化分析仪测定BALF中各类白细胞比例。

1.10 豚鼠肺组织形态学观察

肺组织4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,苏木素—伊红(HE)染色后中性树胶封片,光镜下观察豚鼠肺组织结构及形态。参考Underwood S[9]提出的评估抗原攻击豚鼠肺部炎症变化的组织病理学评分系统,对豚鼠肺组织支气管炎症浸润、上皮细胞损伤、出血、水肿等方面进行评估,依据每个方面的肺组织损害严重程度分为5个等级进行评分。具体评分细则:未见炎症细胞,气管上皮损伤、充血、渗出(0分);轻微炎症浸润,上皮细胞损伤、充血、渗出(1～3分);少量炎症浸润,上皮细胞损伤、充血、渗出(4～6分);中度的炎症浸润,上皮细胞损伤、充血、渗出,支气管平滑肌增生、管腔狭窄(7～9分);较多炎症细胞聚集成团,较严重的气管上皮损伤、充血、渗出,支气管管腔狭窄(10～12分);大量炎症细胞浸润及渗出,严重的上皮细胞损伤、充血,支气管管腔重度狭窄(13～15分)。

1.11 肺泡灌洗液中IgE、细胞因子检测

支气管肺泡灌洗后,离心取上清,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测IgE、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10表达量,按ELISA说明书进行操作。

1.12 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肺组织蛋白表达量

剪取肺组织,称取每份样品质量在100 mg左右,加入1 mL 蛋白裂解液(内含RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF)提取肺组织总蛋白,BCA法测定蛋白水平,SDS-PAGE凝胶电泳,半干转法转移至PVDF膜。转膜完毕后,室温封闭2小时。一抗稀释比例分别为p-ERK(1∶1000)、ERK(1∶1000)、p-p38 MAPK(1∶1000)、p38 MAPK(1∶1000)、p-Akt(1∶2000)、Akt(1∶1000)、p-NF-κB p65(1∶1000)、NF-κB p65(1∶1000)、GAPDH抗体(1∶2000),4℃孵育过夜。TBST洗涤3次后,二抗(1∶3000)室温孵育2 小时。TBST洗涤3次。滴加ECL发光液,采用智能图像工作系统曝光显色,使用Image J 6.0分析蛋白条带灰度值,以目的蛋白与内参蛋白灰度比值表示目的蛋白的相对表达量,并进行均一化处理。

1.13 统计学分析

2 结果

2.1 对豚鼠咳嗽次数和咳嗽潜伏期的影响

与正常组比较,模型组豚鼠咳嗽次数显著增加(P<0.05),咳嗽潜伏期明显缩短(P<0.05);与模型组比较,柴蜕颗粒组和孟鲁司特钠组豚鼠的咳嗽次数显著减少(P<0.05),咳嗽潜伏期明显延长(P<0.05)。见表1。

表1 柴蜕颗粒对豚鼠咳嗽次数及咳嗽潜伏期的影响

2.2 对豚鼠气道阻力的影响

与正常组比较,模型组在0.6 g/L、0.8 g/L乙酰甲胆碱刺激下的气道阻力显著增高(P<0.05);与模型组比较,柴蜕颗粒组和孟鲁司特钠组在0.6 g/L、0.8 g/L激发浓度下的气道阻力显著降低(P<0.05,P<0.01)。见表2。

表2 柴蜕颗粒对乙酰甲胆碱激发下豚鼠气道阻力的影响

2.3 对豚鼠肺组织形态学的影响

正常组豚鼠肺组织结构完整清晰,上皮细胞排列整齐,支气管周围无异常增生、渗出及炎症细胞浸润;与正常组相比,模型组豚鼠可见明显的炎症细胞浸润成团,上皮细胞脱落,毛细血管内充血、水肿,粘液腺、平滑肌细胞增生,支气管腔狭窄,病理评分显著增加(P<0.01);与模型组相比,柴蜕颗粒组豚鼠炎症细胞浸润减少,上皮细胞轻度充血、渗出、脱落,平滑肌增生及支气管狭窄有所改善,病理评分明显降低(P<0.05)。见表3、图1。

注:A:正常组;B:模型组;C:孟鲁司特钠组;D:柴蜕颗粒组。黄色箭头:炎症细胞浸润情况;蓝色箭头:支气管管壁增厚及管腔狭窄情况;黑色箭头:上皮细胞充血、水肿情况。

表3 柴蜕颗粒对豚鼠肺组织形态学的影响

2.4 对豚鼠BALF中炎症细胞水平的影响

与正常组相比,模型组豚鼠BALF中白细胞、EOS、NE、BA比例明显升高(P<0.01)。与模型组相比,柴蜕颗粒组豚鼠BALF中白细胞、EOS、NE、BA比例,以及孟鲁司特钠组豚鼠BALF中EOS、NE比例明显降低(P<0.01),见表4。

表4 柴蜕颗粒对豚鼠BALF中炎症细胞比例的影响

2.5 对豚鼠BALF中IgE、细胞因子的影响

与正常组相比,模型组豚鼠BALF中IgE、IL-4、TNF-α水平显著增高(P<0.05),IFN-γ、IL-10水平显著下降(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,柴蜕颗粒组和孟鲁司特钠组IgE、IL-4、TNF-α含量明显降低(P<0.05,P<0.01),IFN-γ含量明显上升(P<0.05,P<0.01);柴蜕颗粒组豚鼠BALF中IL-10水平显著提升(P<0.05),孟鲁司特钠组IL-10水平有升高趋势,但差异无统计学意义。见表5。

表5 柴蜕颗粒对豚鼠BALF中IgE、细胞因子的影响

2.6 对豚鼠肺组织蛋白表达量及磷酸化水平的影响

与正常组比较,模型组豚鼠肺组织中ERK蛋白表达明显降低(P<0.05),p-ERK水平显著增高(P<0.01);p38 MAPK蛋白表达明显降低(P<0.01),p-p38 MAPK水平显著增高(P<0.05);Akt、p65 NF-κB表达量无显著差异,p-Akt、p-p65 NF-κB水平显著上升(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,柴蜕颗粒组和孟鲁司特钠组豚鼠肺组织中ERK蛋白表达明显增高(P<0.05),p-ERK水平显著降低(P<0.05);p38 MAPK蛋白表达无明显变化,p-p38 MAPK水平显著下降(P<0.05,P<0.01);Akt、p65 NF-κB蛋白水平无显著差异,p-Akt、p-p65 NF-κB水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。见表6～7,图2～3。

注:A:正常组;B:模型组;C:孟鲁司特钠组;D:柴蜕颗粒组。

注:A:正常组;B:模型组;C:孟鲁司特钠组;D:柴蜕颗粒组。

表6 柴蜕颗粒对豚鼠肺组织ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达量及磷酸化水平的影响

表7 柴蜕颗粒对豚鼠肺组织Akt、p-Akt、p65 NF-κB、p-p65 NF-κB蛋白表达量及磷酸化水平的影响

3 讨论

CVA是一类以气道慢性炎症基础上的气道高反应性、气道重塑为病理特征的慢性呼吸系统疾病,发病机制与免疫紊乱导致的炎症反应密切相关。CVA归属于中医学“风咳”“哮咳”的范畴,核心病机为风邪犯肺,子盗母气,脾失健运,凝津成痰,伏藏于肺,成为本病的夙根。外邪引动伏痰,痰气搏结,上逆而咳[10]。柴蜕颗粒方中柴胡、黄芩为君药,佐以防风疏风解表;紫苏子、炒莱菔子、浙贝母理气宽中,降气祛痰;半夏、橘红燥湿化痰,乌梅敛肺止咳,蝉蜕息风止痉,桔梗引诸药上行,共奏疏散风邪,理气化痰,宣肺止咳之功。现代药理学研究发现,柴蜕颗粒复方中主要成分木犀草素、汉黄芩素、β-谷甾醇、豆甾醇等具有抗炎、抗过敏、免疫调节与类激素作用等多种药理活性[11-12]。本研究选取柴蜕颗粒临床等效剂量探索其治疗CVA的药理机制,为临床广泛应用提供依据。

临床研究发现,CVA典型表现为咳嗽敏感性与炎症细胞水平的增高[13]。CVA患者存在以IL-4/IFN-γ比例升高为标志的2型免疫应答亢进与Ⅰ型免疫反应减弱[14],引发局部组织过敏介质释放、炎症细胞募集、炎症因子IL-4、TNF-α分泌进而加剧免疫失衡[15]。炎症迁延难愈、咳嗽反复发作引发气道结构重塑,从而形成不可逆的气流受限[16]。若慢性炎症未得到及时纠正,30%的CVA患者可能进展为典型哮喘[17],阻断炎症级联反应是CVA防治的关键环节。在本研究中,柴蜕颗粒可有效降低CVA豚鼠BALF中EOS、NE水平,抑制促炎细胞因子IL-4、TNF-α与过敏介质IgE的释放,同时提高抑炎细胞因子IFN-γ、IL-10水平,显著改善咳嗽症状。研究结果显示柴蜕颗粒可能通过调节促炎细胞因子与抑炎细胞因子平衡稳态,抑制过敏介质与炎性物质分泌,发挥以气道抗炎为核心的治疗作用。

MAPK参与炎症细胞增殖、分化和运动等多个程序,调控细胞因子和氧化应激引起的细胞信号转导级联反应,ERK 1/2和p38 MAPK是其重要亚型。相关研究表明,ERK/p38 MAPK通路与嗜酸性粒细胞细胞溶质和囊泡低密度组RNase(EAR)的分泌相关,抑制ERK/p38 MAPK通路能够调控趋化因子介导的嗜酸性粒细胞迁移[18],从而缓解CVA豚鼠气道嗜酸性炎症浸润与病理损伤。NF-κB作为炎症发生的重要途径,是近年来炎症和抗炎研究的焦点。Akt通过羧基末端内部 Ser473 位点激活,与MAPK协同调控NF-κB 途径活化与炎症细胞的存活和凋亡。相关研究表明,Akt的异常表达促进NF-κB p65蛋白磷酸化,增强炎症基因的表达与转录[19]。Akt/NF-κB通路激活引发的中性粒细胞性炎症与气道平滑肌细胞增殖相关[20]。柴蜕颗粒缓解中性粒细胞炎症浸润的作用可能与抑制MAPK/Akt/NF-κB通路诱导中性粒细胞凋亡有关。本研究中,柴蜕颗粒干预后,CVA豚鼠肺组织ERK/p38 MAPK通路与Akt/NF-κB通路的磷酸化水平显著降低。本研究结果表明,柴蜕颗粒可能通过下调ERK/p38 MAPK通路表达减轻嗜酸性炎症浸润,抑制Akt/NF-κB信号通路活化以诱导中性粒细胞凋亡,减弱气道平滑肌细胞增殖和迁移。

综上所述,MAPK/Akt/NF-κB通路的异常表达与CVA气道炎症密切相关,柴蜕颗粒可能通过抑制 MAPK/Akt/NF-κB通路活化,下调促炎细胞因子和炎症介质的表达,中断肺组织的炎症级联反应以发挥抗炎作用,从而改善咳嗽症状与肺组织损伤,提高肺功能,发挥对CVA的治疗作用。本研究明确了柴蜕颗粒对细胞因子平衡的调节作用,尚未对免疫细胞增殖、分化、极化的具体情况进行直接观察。后学者可在本研究的基础上,对柴蜕颗粒调节免疫细胞平衡的作用进行深入探索。